《Food Chemistry》：Functionalized carbon nanotube-based affinity chromatography for polyphenol oxidase purification from different sources and evaluation of kinetic properties
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功能性多壁碳纳米管合成及其对植物和蘑菇来源多酚氧化酶的高效纯化与催化动力学研究。
Mehmet Do?an|Fatma Nur Yal?inkaya|Zeynep Bicil|Berna Ko?er Kizilduman|Serap Do?an
土耳其巴勒克埃西尔大学科学与文学学院化学系，邮编10145
摘要
在本研究中，首先合成了功能化的多壁碳纳米管（MWCNT），并将其用于纯化多酚氧化酶（PPO）。通过不同的技术确认了基质的结构特征。功能化处理后，BET比表面积从278.0下降到202.8 m2·g?1。亲和层析法对S. officinalis L.的纯化效果达到了16.4倍，对蘑菇的纯化效果达到了12.9倍，对S. aethiopis L.的纯化效果达到了8.4倍；而SDS-PAGE分析显示S. officinalis L.的分子量约为43–45 kDa，只出现一个明显的条带。最佳pH值和温度值取决于底物和纯化步骤。动力学分析表明，该酶对不同底物表现出依赖性：儿茶酚（K? = 0.0035–0.0050 mM；V?max = 5.000–25.000 EU/mL）、4-甲基儿茶酚（K? = 0.00129–0.00333 mM；V?max = 10.000–14.286 EU/mL）和焦性没食子酚（K? = 0.00075–0.0040 mM；V?max = 5.000–50.000 EU/mL）。由于焦性没食子酚的V?max/K?值较高，因此其催化活性最强。这些结果凸显了功能化MWCNT作为PPO高效纯化载体的潜力，并表明鼠尾草属植物和蘑菇是工业和生物技术应用中潜在的天然酶来源。
引言
在当今世界，技术进步不断影响生物技术和食品科学等关键领域，传统的纯化方法往往无法满足现代应用对选择性、效率和可扩展性的要求。这一挑战推动了多功能和高性能材料的发展，这些材料能够提升酶的纯化效果（?ak?r等人，2021；Yal??nkaya等人，2024；Hussein等人，2019）。多酚氧化酶（PPO；EC 1.14.18.1）是一种含有铜的氧化还原酶，在植物、动物和微生物中广泛存在。它们催化邻二醇类化合物氧化为邻醌，进而聚合生成深色色素，导致水果、蔬菜和其他植物性食品出现酶促褐变。虽然这种反应对植物具有保护作用，但它常常会导致食品的颜色、风味和营养成分发生不良变化，从而成为食品加工和储存中的主要问题（Do?an等人，2007；Do?an等人，2009；Do?an等人，2013；Gomes等人，2014）。
了解PPO的结构、催化行为和抑制机制对于开发控制酶促褐变的有效策略以及探索其在生物技术和工业应用中的潜力至关重要。然而，由于PPO具有膜结合性质、含量低且存在多种同工酶，其纯化过程颇具挑战性。传统的纯化方法（如硫酸铵沉淀、透析、凝胶过滤和离子交换层析）虽然可以部分纯化PPO，但通常耗时、劳动强度高，并可能造成酶活性损失（Do?an等人，2005；?akiro?lu，1994；Zou等人，2024）。因此，亟需开发更高效、更具选择性和经济性的纯化方法。亲和层析法被认为是最有效的纯化技术之一，具有高特异性和分辨率。近年来，由于纳米材料独特的物理化学性质（如高比表面积和可调表面化学性质），将其整合到亲和系统中引起了广泛关注。
碳纳米管（CNT）是一维纳米结构，由石墨烯层卷曲而成，具有高比表面积、优异的机械强度和可调的表面化学性质（Bicil，2026）。这些特性使得CNT能够通过π-π堆叠、氢键和静电作用与生物分子发生强烈相互作用。然而，未经改性的CNT缺乏反应性表面基团，限制了其化学活性和与生物分子的相互作用。Mohammadi等人（2009）的研究清楚地表明了这一点：未改性的SWCNT对PPO的吸附性能和电化学性质较差，原因是纳米管表面缺乏功能基团。这些发现强调了表面修饰的必要性，以改善结合能力和酶的固定性能（Mohammadi等人，2009）。通过引入-COOH、-OH和-NH?等化学基团对CNT进行功能化，可以提升其生物相容性和选择性吸附能力，使其成为酶纯化和固定的理想材料（Gomes等人，2014；Ombaka等人，2014；Oyetade等人，2015）。多壁碳纳米管（MWCNT）具有多层石墨烯结构，结构稳定、结合位点密度高且易于再生，适合作为亲和载体（?am等人，2025）。与传统的Sephadex/Sepharose凝胶相比，基于MWCNT的载体具有更高的吸附能力、可重复使用性和成本效益。此外，功能化的MWCNT在电化学生物传感领域也有广泛应用，其高比表面积和石墨π系统结合定制的表面化学性质使得酶在温和条件下能够稳定且定向固定，同时减少非特异性吸附。将这些原理应用于纯化过程中，可以带来三个优势：在π-活性、高结合位点密度表面上更高的捕获概率；配体-间隔基团引导的选择性；以及温和的、保持酶活性的洗脱过程（Dubey等人，2021；Oskin等人，2023；Wee等人，2019）。
唇形科植物富含酚类化合物、黄酮类和精油，具有抗氧化和酶活性。其中，鼠尾草属植物（Salvia）因其高PPO活性而特别值得关注。Salvia aethiopis L.和Salvia officinalis L.含有丰富的酚类化合物和强酶活性，是PPO提取和研究的理想来源（Dorman等人，2004；Kürkcüo?lu等人，2001；?atak & Atalay，2022）。蘑菇常被用作研究PPO介导的酶促褐变的经典模型系统，因为多酚氧化酶在酚类底物的氧化及后续品质劣化过程中起关键作用（Ma等人，2025）。尽管已有大量关于不同来源PPO的研究（?am等人，2025；Do?an等人，2005，2009，2013），但据我们所知，目前尚未有研究将纳米结构碳材料与亲和层析法结合用于从Salvia aethiopis L.、Salvia officinalis L.和蘑菇中纯化PPO。在这方面，功能化的MWCNT代表了一代新型亲和载体，结合了高反应性的纳米结构和特定的酶结合能力。在本研究中，设计了一种化学功能化的MWCNT基亲和载体，用于从Salvia aethiopis L.的叶片和花朵、Salvia officinalis L.的叶片以及蘑菇中纯化PPO。通过使用儿茶酚、4-甲基儿茶酚和焦性没食子酚作为底物，评估了纯化效果（包括特异性活性、纯化倍数和产率）。成功纯化了S. aethiopis L.中的PPO并研究了其动力学性质，同时使用S. officinalis L.中的PPO进一步评估了该亲和载体的选择性。这种基于纳米材料的策略提供了一种可重复使用、经济高效且高效的纯化方法，推动了纳米材料辅助酶纯化技术的发展。
材料
本研究中使用的MWCNT购自Nanografi公司（纯度99%）；聚乙二醇购自Sigma-Aldrich。其他所有化学试剂均为分析级，市售产品，无需进一步纯化即可使用。用于PPO纯化的植物样本属于唇形科，Salvia aethiopis L.采集于2023年5月，Salvia officinalis L.采集于2025年11月，均来自土耳其巴勒克埃西尔省。
FTIR分析
图2中的FTIR光谱显示了MWCNT各功能化步骤的特征谱带。原始MWCNT（A）的光谱在1554 cm?1处有一个谱带，对应于C=C伸缩振动，表明纳米管的石墨结构得以保留（Vesali Naseh等人，2009）。羟基化MWCNT（MWCNT-OH）（B）的光谱在3439 cm?1处有一个谱带，证实了-OH基团的存在。
结论
本研究表明，用L-酪氨酸和对氨基苯甲酸改性的多壁碳纳米管为从Salvia aethiopis L.、Salvia officinalis L.和蘑菇中纯化多酚氧化酶提供了高效且高选择性的亲和平台。设计的亲和载体对S. aethiopis L.叶片提取物的纯化效果达到了8.4倍，对花朵提取物的纯化效果达到了3倍，证明了其对叶片来源酶的强选择性。
作者贡献声明
Mehmet Do?an：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、项目监督、方法论设计、数据分析、概念构建。Fatma Nur Yal?inkaya：验证、软件使用、资源协调、方法论设计、实验实施、数据管理。Zeynep Bicil：初稿撰写、验证、软件使用、资源协调、方法论设计、实验实施、数据管理。Berna Ko?er Kizilduman：初稿撰写、验证、软件使用、
未引用参考文献
Al-Najada和Mohamed，2014
Do?an, Turan, Do?an, Alkan和Arslan，2008
Keru, Ndungu和Nyamori，2014
利益冲突声明
作者声明以下可能构成利益冲突的财务关系/个人关联：本研究得到了TUBITAK的支持（项目编号：122Z634）。
致谢
本研究得到了TUBITAK（项目编号：122Z634）的支持。
