《Frontiers in Immunology》：Electroacupuncture alleviates pain by activating the MD2/TLR4/NF-κB pathway in the ST36 acupoint
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本研究发现，电针（EA）刺激足三里（ST36）穴可通过激活穴区局部免疫细胞（如成纤维细胞、肥大细胞）中的髓样分化蛋白2（MD2）/Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信号通路，进而动态调节脊髓背角Grem1/BMP4/环氧合酶2（COX2）轴的平衡，从而发挥系统性镇痛作用。该研究从“穴位启动”理论视角，揭示了MD2作为连接穴位微环境与中枢调控的关键分子枢纽，为疼痛治疗提供了新靶点。
引言
疼痛是临床最常见的症状之一，严重影响患者的生活质量。电针（EA）作为结合传统针灸与现代电刺激技术的创新疗法，在疼痛缓解方面展现出优势。其镇痛效应涉及从外周至中枢多个系统的相互作用，而穴位是针刺疗法起效的关键初始部位。既往研究证实，穴位区域的NF-κB通路介导了针刺的治疗作用。因此，本研究聚焦于深入探究ST36穴区的MD2/TLR4/NF-κB轴在EA镇痛中的作用。
材料与方法
本研究使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，通过足底注射完全弗氏佐剂（CFA）建立佐剂性关节炎（AIA）炎性痛模型。EA干预施加于双侧足三里（ST36）穴位，刺激参数为2/15 Hz疏密波，电流强度≤0.05 mA，每日30分钟。假EA（SHAM）组仅插入针具但不给予电流。通过行为学（热缩足阈值，PTWT）、蛋白质印迹（WB）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光（IF）以及慢病毒介导的穴区MD2基因敲低和过表达等技术，综合探究MD2在EA镇痛中的角色。
结果
EA对AIA小鼠的镇痛效果
成功建立AIA模型后，小鼠PTWT显著降低（P< 0.01）。与SHAM组相比，EA干预从第3天（D3）起显著提高了AIA小鼠的PTWT（P< 0.01），并持续至第7天（D7），表明EA产生了明确的镇痛作用。同时，EA降低了脊髓中疼痛相关指标蛋白激酶C（PKC）和CX3CL1的水平（P< 0.01）。
EA对ST36穴区MD2/TLR4/NF-κB通路的影响
WB分析显示，EA治疗7天后，ST36穴区内MD2、TLR4蛋白表达以及NF-κB通路关键蛋白磷酸化p65（p-p65）与总p65的比值（p-p65/p65）均显著上调（P< 0.01）。Co-IP实验进一步证实了MD2与TLR4在ST36穴区存在相互作用。
MD2/TLR4在ST36穴区表达的时序性模式
为探究MD2激活的时间规律，研究人员检测了不同时间点穴区MD2的表达。发现MD2蛋白水平在EA干预后第5天（D5）出现统计学意义的显著升高（P< 0.05），而TLR4的表达在D5时尚未变化，直至D7才显著增加。这表明EA对MD2的影响先于TLR4/NF-κB通路的完全激活，MD2可能是通路启动的早期事件。
MD2和TLR4在ST36穴区的细胞定位
IF结果显示，MD2与TLR4在ST36穴区存在共定位。TLR4与标志成纤维细胞的Vimentin、标志肥大细胞的Tryptase均有显著共定位，且EA处理后共定位细胞数进一步增加（P< 0.01 或 P< 0.05）。TLR4与标志巨噬细胞的F4/80也有共定位，但变化无统计学意义。这提示成纤维细胞和肥大细胞是穴区MD2/TLR4/NF-κB信号激活的关键靶细胞。
调控穴区MD2对EA镇痛效应及下游通路的影响
为验证MD2的功能必要性，研究使用慢病毒在ST36穴区特异性敲低或过表达MD2。结果表明，敲低MD2部分逆转了EA的镇痛效果（P< 0.05, P< 0.01）并抑制了局部TLR4和p-p65/p65的表达。相反，过表达MD2本身即可产生部分镇痛效应（P< 0.05, P< 0.01）并上调通路组分。这些功能实验证实，MD2是EA镇痛效应产生和维持的必要因素。
蛋白质组学揭示穴区MD2调控对脊髓镇痛通路的影响
对脊髓组织进行蛋白质组学分析发现，EA干预依赖穴区MD2调控了脊髓中多个蛋白的表达。其中，骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂Grem1的表达在EA后上调，而被MD2敲低所逆转。WB验证进一步表明，EA通过上调Grem1，抑制了其下游靶点BMP4和COX2在脊髓中的表达（P< 0.01）。Grem1/BMP4/COX2轴是参与脊髓痛觉调控的重要通路，该结果揭示了穴区局部信号影响中枢镇痛的关键分子事件。
讨论
本研究系统阐明了EA通过ST36穴区MD2/TLR4/NF-κB通路产生累积性镇痛效应的分子机制。EA刺激首先在穴区微环境中上调MD2表达（约D5），进而激活TLR4/NF-κB信号通路（D7），该过程主要发生于成纤维细胞和肥大细胞。穴区信号的激活进一步通过尚待完全阐明的“穴位-脊髓”通讯机制（可能涉及神经传导或体液因子），调控脊髓背角Grem1/BMP4/COX2轴的动态平衡，最终实现系统性镇痛。MD2在此过程中扮演了连接穴位局部免疫反应与中枢疼痛调控的关键枢纽角色。值得注意的是，MD2介导的只是EA镇痛的部分机制，表明EA镇痛是一个多靶点、网络化的过程。穴区内不同细胞（成纤维细胞、肥大细胞、巨噬细胞）可能通过协同作用，共同将物理刺激转化为复杂的生化信号。
结论
本研究揭示了一种由ST36穴区局部炎症-MD2轴介导的双向调控机制，是EA产生累积性镇痛效应的基础。穴区炎症微环境上调MD2表达，特异性激活成纤维细胞和肥大细胞中的TLR4/NF-κB信号级联，进而动态调节脊髓背角Grem1/BMP4/COX2轴的平衡。EA通过放大穴区MD2介导的“炎症启动”效应，实现了局部炎症状态与中枢镇痛通路的同步调控。这些发现不仅确认了MD2是连接穴位微环境与中枢调控的关键分子枢纽，也通过阐明上游NF-κB通路激活机制和确立“局部-系统性”协同原则，深化了穴位疗法的理论基础。
