《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Circulating exosomal miR-550a-5p/miR-665 identify coronary microvascular dysfunction and drive endothelial–myocyte crosstalk in type 2 diabetes
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本研究揭示了循环外泌体miR-550a-5p与miR-665在2型糖尿病（T2DM）中作为冠状动脉微血管功能障碍（MD）的新型生物标志物，并证实miR-550a-5p通过Hippo–eNOS（内皮型一氧化氮合酶）信号通路及外泌体转移，介导了内皮细胞应激向心肌细胞损伤的传递。该发现为T2DM患者早期微血管功能障碍的检测、心肌损伤风险分层及机制干预提供了新视角。
引言
2型糖尿病（T2DM）是心血管疾病发病的主要驱动因素，微血管病理现已被认为是从代谢应激到器官功能障碍连续过程中的核心病理生理组成部分。在心脏中，微血管功能障碍（MD）损害毛细血管密度和内皮信号传导，限制灌注和适应性储备，从而易导致心肌细胞损伤、不良重构，并最终发展为舒张功能障碍和射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）。目前，常规护理中的风险分层仍依赖于全身代谢指标（如糖化血红蛋白HbA1c）、非特异性炎症替代指标或下游超声心动图变化，这些对于早期检测均不理想。这一差距促使人们寻求能够同时反映MD存在和心肌损伤倾向的非侵入性循环生物标志物，理想情况下能捕捉高血糖下的实时血管-心脏对话。
细胞外囊泡（EVs），尤其是外泌体，为此类生物标志物提供了生物学基础。外泌体是由大多数细胞类型释放的纳米级脂质双分子层囊泡（约30–150 nm），携带蛋白质、脂质和核酸（包括微小RNA，miRNA）。由于其内容物受膜保护并受细胞应激源（如氧化应激和营养过剩）动态调控，外泌体能反映组织状态，并能在局部和系统层面重编程受体细胞。这些特性奠定了两个互补的应用方向：（i）诊断学，即循环外泌体miRNA可作为亚临床血管损伤的稳健液体活检指标；（ii）治疗学，即修饰外泌体内容物可增强糖尿病背景下的内皮修复和血管生成。这些特性共同使循环外泌体miRNA成为糖尿病相关MD及其心肌后果的分析上具吸引力且临床可及的指标。
材料与方法
本研究整合了基于基因表达综合数据库（GEO）的发现、临床验证和机制验证。通过生物信息学分析，从GEO数据集（GSE262614）中筛选出在糖尿病微血管功能障碍患者中差异表达的循环外泌体miRNA，并与疾病相关miRNA数据库（HMDD, miRNet）交集，最终锁定hsa-miR-550a-5p和hsa-miR-665作为关键候选分子。对候选miRNA的预测靶基因进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及转录因子（TF）预测。
临床研究纳入了一个表型明确的T2DM队列，通过定量检测血浆外泌体中的miR-550a-5p/miR-665水平，分析其与MD和心肌损伤的关系。外泌体通过差速超速离心法从血浆中分离，并通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和免疫印迹（检测TSG101、CD63、HSP70）进行表征。
机制研究中，在高糖条件下培养的人心脏微血管内皮细胞（HCMECs）中调控miR-550a-5p的表达，分析其对Hippo–YAP/eNOS信号通路的影响，并评估其外泌体对人心肌细胞（AC16）的转移效应，同时应用Hippo通路抑制剂XMU-MP-1作为挽救策略。功能实验包括细胞活力（CCK-8）、迁移（Transwell）、成管（Matrigel）以及细胞凋亡（TUNEL染色）、氧化应激（活性氧ROS、丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD）等相关检测。
结果
候选miRNA的鉴定与生物信息学分析
差异表达分析鉴定出264个在糖尿病MD患者中显著失调的miRNA。与疾病相关数据库交集后，确定了两个关键miRNA：hsa-miR-550a-5p和hsa-miR-665。功能富集分析显示，其预测靶基因显著富集于间充质发育、TGF-β受体结合、组蛋白修饰活性等GO条目，以及MAPK、Hippo、FoxO等KEGG信号通路，特别是与糖尿病并发症密切相关的细胞衰老和AGE–RAGE信号通路。PPI网络识别出核心枢纽基因，并构建了整合的miRNA-基因-TF调控网络。
临床表达与诊断价值
在临床队列中，与无微血管功能障碍（NMD）组相比，MD组患者血浆外泌体中miR-550a-5p和miR-665的表达水平显著上调。进一步地，在伴有心肌损伤（MD-MI）的亚组中，这两种miRNA的表达水平显著高于不伴心肌损伤（MD-NMI）的亚组。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，外泌体miR-550a-5p和miR-665区分MD与NMD的曲线下面积（AUC）分别为0.840和0.829，表现出良好的诊断性能。此外，两者表达水平与心肌损伤标志物（肌钙蛋白T（TnT）、肌钙蛋白I（TnI）、N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）、肌酸激酶同工酶（CK-MB））呈显著正相关。
miR-550a-5p在内皮细胞中的功能作用
在高糖处理的HCMECs中，miR-550a-5p表达显著上调。抑制miR-550a-5p可显著改善高糖诱导的内皮细胞活力下降、迁移能力减弱和成管功能障碍，并部分恢复磷酸化eNOS（p-eNOS）与总eNOS的比值。同时，高糖激活了Hippo通路（MST1、LATS1表达上调，LATS1和YAP磷酸化增加），而抑制miR-550a-5p或使用Hippo通路抑制剂XMU-MP-1均可减轻这种激活，并协同改善内皮功能，提示miR-550a-5p与高糖下的Hippo通路激活和内皮功能障碍相关。
外泌体介导的miR-550a-5p从内皮细胞向心肌细胞的转移
表征确认从HCMECs成功分离出高纯度外泌体。高糖条件来源的外泌体（H-Exo）中miR-550a-5p含量显著高于正常糖条件（N-Exo）。将DiI标记的外泌体与AC16心肌细胞共培养，证实外泌体可被心肌细胞内化，并导致心肌细胞内miR-550a-5p水平升高。功能实验表明，与H-Exo共培养会加剧高糖诱导的心肌细胞活力下降、凋亡增加（TUNEL阳性细胞增多，Cleaved Caspase-3、Bax表达上调，Bcl-2下调）、乳酸脱氢酶（LDH）释放增多以及氧化应激水平升高（ROS和MDA水平上升，SOD活性下降）。然而，使用来自miR-550a-5p被抑制的内皮细胞的外泌体（H-in-miR-Exo）进行处理，则能显著减轻这些 detrimental 效应。
讨论
本研究结果确定了循环外泌体miR-550a-5p与miR-665可作为糖尿病中内皮-心肌细胞耦合的临床可行生物标志物。在系统水平上，这些信号与HFpEF范式一致，即冠状动脉MD是导致心肌重构和症状发展的上游过程。在分子水平上，研究结果整合了外泌体miRNA研究的两个线索：一是血管源性EV-miRNA（如miR-30家族）在氧化损伤、内皮衰老和冠状动脉稀疏早期即升高；二是恢复内皮miRNA程序（如运动诱导的miR-126）对于保护实验性糖尿病中的冠状动脉结构和心脏功能是必要的。内皮-心肌细胞转移实验表明，内皮来源的外泌体miR-550a-5p的功能与Hippo–YAP通路活性相关，这为微血管应激与心肌细胞易损性之间提供了机制上合理的联系。
临床方面，将外泌体miR-550a-5p/miR-665与微血管功能表型分析结合，可增强T2DM的早期风险分层。超越诊断，从基于EV的治疗策略（如通过调控供体细胞重编程外泌体miRNA货物以增强内皮修复）中获得可行性信号，支持了开发靶向miR-550a-5p或Hippo节点的策略作为以微血管为中心的心脏保护措施的潜力。
研究的局限性包括单中心、横断面设计，生物信息学发现依赖于小样本公共数据集，外泌体分析可能存在异质性和共分离脂蛋白的影响，以及体外模型的局限性。未来需要多中心前瞻性研究、直接冠状动脉微血管表型分析以及体内验证来确立时间优先性、因果性和转化相关性。
结论
外泌体miR-550a-5p与miR-665在2型糖尿病中充当双重用途信号：既是冠状动脉微血管功能障碍的可及性生物标志物，也是内皮-心肌细胞通讯的候选介质，其机制与Hippo–YAP/eNOS信号通路相关。临床上，将这些miRNA与直接微血管表型分析结合，为完善风险分层和动态监测提供了途径。在机制上，靶向miR-550a-5p/Hippo节点可能有助于恢复内皮功能并减轻外泌体携带的损伤信号。
