《Frontiers in Microbiology》：Effects of different doses of oregano essential oil on growth performance, health parameters, and the gut microbiome-metabolome profile in heat-stressed Pinan cattle (Piedmontese × Nanyang)
编辑推荐：
本研究首次系统评估了牛至精油（OEO）在持续严重热应激（THI ≈ 86）条件下对平南牛（皮埃蒙特×南阳）的健康改善作用。结果表明，低剂量OEO（7 g/天）能显著优化肝功能（降低ALT、AST，提升ALB、TP）、增强免疫（提高IgA、IgM）与抗氧化 status（降低MDA，提高SOD、CAT），并富集瘤胃有益菌群（Bacteroidota, Prevotella），调控宿主-微生物-代谢物互作网络；而高剂量（14 g/天）仅提升GSH-Px和T4，且对瘤胃菌群无显著调节，呈现“阈值效应”。推荐低剂量OEO作为精准缓解肉牛热应激的天然策略。
引言：夏季热应激对全球牛肉生产构成重大挑战。肉牛由于瘤胃发酵产生的代谢热和其绝缘性被毛，特别容易受到热应激的影响。当温湿度指数（THI）超过临界阈值时，牛会表现出热应激的特征性迹象，包括采食量减少和瘤胃功能受损。为维持体温稳态，会激活生理反应，例如抑制下丘脑摄食中心以减少食欲，并最大限度地减少采食和反刍产生的内源性热量。这种系统性应激源会深刻扰乱胃肠道生态系统。热应激通过核心体温升高、采食量减少和饮水改变的共同作用，诱导瘤胃和肠道菌群失调。这种转变通常会消耗有益的纤维素分解菌，同时富集潜在的病原体和乳酸生产者，从而损害挥发性脂肪酸谱、纤维消化率和肠道屏障完整性。由此产生的内毒素易位和炎症反应加剧了全身性代谢失调。作为中心代谢器官，肝脏在热应激下受到严重损害。它面临着维持糖异生和对抗氧化损伤的双重挑战。持续的氧化应激抑制脂肪酸氧化和输出，导致肝脏脂肪变性。同时，线粒体功能障碍增加了活性氧（ROS）的产生，而关键抗氧化酶（例如SOD、GSH-Px、CAT）被耗竭，最终导致肝细胞损伤。鉴于这种多方面的病理生理学，需要具有多靶点效应的天然干预措施。牛至精油（OEO）富含百里香酚和香芹酚等生物活性酚类，在减轻牲畜热应激方面显示出潜力。其潜在机制包括调节肠道微生物群、缓解氧化应激和调节免疫反应。然而，其在热应激肉牛中的功效和机制需要系统阐明。这一知识空白对于平南牛（皮埃蒙特×南阳）尤其重要，该品种以其快速生长和高肉品质而闻名。尽管具有经济重要性，但这种新培育品种对热应激的生理反应以及像OEO这样的缓解剂的功效仍未得到探索。因此，本研究首次对平南牛补充OEO进行了全面评估。我们采用整合多组学方法，超越常规的生长和抗氧化评估，以揭示复杂的主-微生物-代谢物相互作用。我们的目标是确定OEO对热应激损伤通路的剂量依赖性效应，并为增强该独特品种的耐受性提供基于证据的建议。
材料与方法：实验于2024年6月至8月进行。36头健康的12月龄平南（皮埃蒙特×南阳）公牛，初始体重均匀（380 ± 25 kg），来自河南省新野县恒永肉牛养殖合作社（32°17′N, 110°58′E）。采用完全随机设计，将牛只分配到三种日粮处理（n = 12头/处理）。处理为：CON，基础日粮；L-OEO，基础日粮 + 7 g OEO/天/头；H-OEO，基础日粮 + 14 g OEO/天/头。经过7天日粮适应期后，所有公牛进入60天实验期，期间按处理分配开始并维持OEO补充。牛只每天两次（06:00和18:00）饲喂全混合日粮（TMR）。每头牛的每日OEO剂量首先与少量TMR（载体）均匀混合，然后将此预混料使用混合机彻底混入个体整个18:00的TMR部分中，以确保均匀分布。该固定饲喂方案（每次10 kg，每天20 kg）旨在标准化营养和OEO摄入量。记录每日剩料，可忽略不计（<5%），证实实际OEO摄入量与预期剂量相符。使用的牛至精油（OEO）由菲迪科技提供。气相色谱-质谱（GC-MS）化学表征确定该油主要由酚类化合物主导，两种主要生物活性酚类百里香酚和香芹酚分别占24.97%和64.96%，合计相对丰度为89.93%，明确归类为香芹酚-百里香酚化学型。在每日热高峰（14:00）记录环境温度（T, °C）和相对湿度（RH, %），并计算温湿度指数（THI）。热应激严重程度分类为THI ≤ 74（无应激）、75–78（轻度）、79–83（中度）和≥ 84（重度）。在第1天和第60天，在禁食12小时（允许饮水）后于06:00记录体重。计算平均日增重（ADG）和饲料转化率（FCR）。采集血样、瘤胃液和粪便样本，用于血清生化参数分析、非靶向代谢组学分析以及瘤胃和肠道微生物群（16S rRNA测序）分析。使用商业检测试剂盒测定血清免疫球蛋白（IgA、IgM、IgG）、抗氧化指标（T-AOC、T-SOD、GSH-Px、MDA、CAT）、热休克蛋白70（HSP70）、皮质醇（COR）、三碘甲状腺原氨酸（T3）和甲状腺素（T4）。使用全自动生化分析仪测量丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、尿素（UREA）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）和游离血红蛋白（Hb）。血清非靶向代谢组学使用超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）进行分析。瘤胃液和粪便样本的16S rRNA基因测序在个人生物生物技术有限公司进行。使用Pearson相关分析探讨差异丰富的肠道/瘤胃微生物与差异血清代谢物之间的关系，并进行错误发现率（FDR）校正。所有数据使用SPSS软件进行单因素方差分析（ANOVA），个体动物被视为实验单位（n = 12/处理）。当ANOVA表明存在显著的整体处理效应（p < 0.05）时，使用LSD事后检验进一步评估个体处理均值之间的差异。
结果：
生长性能：试验期间，平均THI在所有组中均超过84，表明存在持续的严重热应激。呼吸频率在各组间无差异（p > 0.05）。同样，初始体重、最终体重和平均日增重（ADG）均无显著差异（p > 0.05）。
血清生化参数：OEO补充60天显著改善了肝损伤、蛋白质代谢和合成功能的标志物。与CON相比，两个OEO处理组的血清ALT（p < 0.05）和AST（p < 0.01）浓度均显著降低。低剂量组的白蛋白（ALB）浓度显著高于高剂量组（p < 0.01）和对照组（p < 0.01）。高剂量组的ALB也显著高于对照组（p < 0.05）。总蛋白（TP）在L-OEO和H-OEO中也显著升高（p < 0.01）。此外，与CON相比，L-OEO（p < 0.05）和H-OEO（p < 0.01）的尿素（UREA）浓度显著降低。在免疫功能方面，OEO补充显著增强了早期免疫反应。L-OEO和H-OEO的血清IgA浓度均显著高于CON（p < 0.01），IgM浓度也显著高于CON（p < 0.05）。在抗氧化能力方面，H-OEO的GSH-Px活性显著高于L-OEO和CON（p < 0.01）。两个OEO补充组的SOD活性均显著高于对照组（p < 0.05）。L-OEO的CAT活性显著高于CON（p < 0.05），而H-OEO与L-OEO或CON之间未观察到显著差异（p > 0.05）。L-OEO的MDA最低，与CON（p < 0.01）和H-OEO（p < 0.05）均存在差异，而H-OEO也低于CON（p < 0.05）。对于其他血清生化指标，H-OEO的血红蛋白（Hb）浓度显著低于CON（p < 0.05）。相反，H-OEO的甲状腺素（T4）浓度显著高于CON（p < 0.05）。对于Hb和T4，H-OEO和L-OEO之间未检测到显著差异（p > 0.05）。
血清非靶向代谢组学：非靶向代谢组学分析在血清样本中总共检测到31,747个代谢物特征。主成分分析（PCA）显示，在正离子模式下，OEO补充组（L-OEO和H-OEO）与对照组（CON）的代谢谱存在明显分离，而L-OEO和H-OEO的代谢谱彼此间未清晰分离。相比之下，在负离子模式下，任何组别间均未检测到明显的分离。差异代谢物筛选（p < 0.05，FC > 1.5 或 FC < 0.58）表明，L-OEO和H-OEO之间的差异代谢物主要包括各种磷脂酰胆碱（PCs）。L-OEO与CON的比较揭示了包括多种PCs、异丁酰甘氨酸、N-乙酰缬氨酸、羟苯乙酰甘氨酸、2-甲基丁酰甘氨酸（2-MBG）、百里香酚硫酸酯和二十二碳六烯酸乙酯在内的代谢物发生显著改变。同时，H-OEO与CON之间的差异代谢物包括异丁酰甘氨酸、N-乙酰缬氨酸、羟苯乙酰甘氨酸、百里香酚硫酸酯、甘氨脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸和胆酰丙氨酸。KEGG通路富集分析显示，在任何成对比较（L-OEO vs. CON, H-OEO vs. CON, L-OEO vs. H-OEO）中，没有通路达到统计学显著性阈值（FDR校正p值 < 0.05）。
16S微生物组学：OEO给药对瘤胃和肠道微生物群落施加了不同的调节作用。在门水平上，肠道中的优势菌门是厚壁菌门A（Firmicutes_A）和拟杆菌门（Bacteroidota），两者合计占总细菌丰度的90%以上。两个OEO补充组（L-OEO和H-OEO）的疣微菌门（Verrucomicrobiota）相对丰度均显著低于CON（p < 0.05）。其余各门在各组间未观察到显著差异（p > 0.05）。在瘤胃中，优势菌门同样是拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门A（Firmicutes_A）。与CON相比，L-OEO的拟杆菌门（Bacteroidota）丰度显著增加（p < 0.05），而厚壁菌门A（Firmicutes_A）丰度极显著降低（p < 0.01）。相比之下，H-OEO与CON之间的微生物组成未观察到显著差异（p > 0.05）。此外，L-OEO的纤维杆菌门（Fibrobacterota）丰度显著高于H-OEO和CON。在属水平上，粪球菌属（Faecalicoccus）和隐杆菌属（Cryptobacteroides）是所有组别肠道中的优势菌属。L-OEO的隐杆菌属（Cryptobacteroides）丰度显著高于H-OEO和CON（p < 0.05）。在瘤胃中，优势菌属是普雷沃菌属（Prevotella）和隐杆菌属（Cryptobacteroides）。与H-OEO和CON相比，L-OEO的普雷沃菌属（Prevotella）丰度显著更高（p < 0.01）。相反，L-OEO的隐杆菌属（Cryptobacteroides）丰度显著低于H-OEO和CON（p < 0.01）。此外，L-OEO的Sodaliphilus丰度显著低于CON（p < 0.05），而L-OEO和H-OEO之间未观察到显著差异（p > 0.05）。α多样性指数（Chao1和Shannon）分析显示，三个处理组在瘤胃和肠道微生物群中均无显著差异（所有p > 0.05），表明OEO补充并未改变微生物群落的整体丰富度或均匀度。使用非度量多维尺度（NMDS）评估肠道和瘤胃微生物群的β多样性。肠道微生物群落中未观察到明显的聚类模式。相比之下，瘤胃微生物群中存在明显的分离，L-OEO和H-OEO的样本形成与CON不同的簇。线性判别分析（LDA）显示，在肠道中，隐杆菌属（Cryptobacteroides）在L-OEO中显著富集。未发现H-OEO中显著富集的特征性微生物类群，而疣微菌门（Verrucomicrobiota）在CON中显著富集。在瘤胃中，低剂量OEO补充导致拟杆菌科（Bacteroidaceae）和普雷沃菌属（Prevotella）显著富集。相比之下，高剂量OEO补充与毛螺菌目（Lachnospirales）和丁酸弧菌属（Butyrivibrio）的显著富集相关。使用PICRUSt2进行系统发育调查，预测京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路丰度。在错误发现率（FDR）校正后，任何组间比较（CON vs. L-OEO, CON vs. H-OEO, 或 L-OEO vs. H-OEO）均未发现Level 3的KEGG通路存在显著差异（所有q > 0.05）。
整合分析：进行Pearson相关分析以探讨各组间差异丰富的肠道/瘤胃微生物与血清代谢物之间的关系。经过严格的FDR校正（Benjamini–Hochberg方法）后，在肠道和瘤胃中均鉴定出稳健的微生物-代谢物关联。最显著的关联网络出现在L-OEO和CON组之间的瘤胃比较中，关键细菌属（例如普雷沃菌属Prevotella、隐杆菌属Cryptobacteroides、UBA4334）与多种磷脂和氨基酸代谢物显示出极强的相关性（所有r > 0.75, q < 0.01）。
讨论：热应激降低采食量，增加呼吸频率，并扰乱平南牛的瘤胃发酵，共同导致负能量平衡。同时，高环境温度促进线粒体内膜脂质过氧化，并增加复合物I和III的电子泄漏，从而增加超氧阴离子（O2?•）的产生。此外，受抑制的ATP合酶活性降低了能量生产效率。这些代谢改变共同引发过量的活性氧（ROS）生成，导致广泛的氧化损伤。通过固定每日摄入量，消除了采食量约束；因此，ADG的数值上升反映了日粮养分转化为活重的效率真正提高。血清生化参数分析表明，OEO补充显著降低了肝损伤标志物（ALT和AST）和蛋白质分解代谢（UREA），同时增强了合成功能指标（ALB和TP）。这些结果表明，OEO通过保护肝细胞和改善蛋白质代谢来缓解热应激诱导的肝损伤。值得注意的是，L-OEO在促进蛋白质合成方面表现出更大的功效，而H-OEO导致血尿素氮更显著的降低。在免疫反应方面，OEO补充显著提高了早期免疫介质（IgM）和粘膜免疫相关抗体（IgA），但未显著影响长期免疫球蛋白（IgG）。这些观察结果与热应激下已确立的免疫转变一致，即抑制Th1介导的细胞免疫，同时促进Th2驱动的体液反应。这表明OEO可能主要通过增强体液免疫途径来对抗热诱导的免疫抑制。关于抗氧化能力，L-OEO表现出脂质过氧化产物MDA的显著降低和CAT活性的增加，而H-OEO表现出GSH-Px活性的显著增强。这种剂量依赖性变异可能反映了OEO主要活性成分香芹酚和百里香酚的浓度相关生物活性。SOD活性的同时增加进一步支持了氧化应激的协同缓解，尽管总体抗氧化能力未显著改善。COR水平无显著变化表明OEO可能有助于减弱下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的过度激活。H-OEO中T4的显著增加表明甲状腺激素参与了OEO补充介导的代谢调节。同时，游离Hb的降低表明红细胞膜稳定性增强，这与抗氧化状态的总体改善一致。这些发现表明，OEO有效减轻了热应激平南牛的肝损伤，改善了代谢功能，增强了免疫反应，并增强了抗氧化能力。其益处可能由OEO的主要生物活性成分百里香酚和香芹酚介导，它们通过提供电子中和超氧阴离子，提供直接的抗氧化保护并上调关键酶（GSH-Px、SOD、CAT）。因此，内源性抗氧化防御系统得到全面加强。低剂量和高剂量补充之间的不同反应表明，较低剂量可能对特定生理终点是最优的。值得注意的是，抗氧化和免疫参数的改善是在呼吸频率（热应激的常规临床指标）没有显著变化的情况下发生的。这种明显的差异可以通过这些测量所处的不同生物组织层次以及OEO的主要作用机制来解释。呼吸频率是由下丘脑体温调节中心协调的整体动物、综合性生理反应，以最大化蒸发散热。它的调节通常是一个难治的终点，直到核心体温发生显著改变时才可能产生反应。相比之下，测量的抗氧化和免疫参数（例如SOD、CAT、IgA）反映了细胞和生化环境，它们更直接地受到百里香酚和香芹酚等膳食生物活性化合物的影响。观察到的分歧表明，OEO补充对热应激牛的有益作用可能主要在亚生理水平上运作。通过直接清除ROS并可能上调内源性抗氧化酶的表达，OEO在组织内从其源头减轻氧化损伤。类似地，其免疫调节作用可能通过直接与免疫细胞和肠道相关淋巴组织相互作用来介导。这种细胞内和分子水平的改善可以独立于动物散热的努力而发生，并且可能先于其变化。因此，抗氧化和免疫系统的增强代表了OEO功效的更敏感和早期指标，强调了其在外部应激源（高THI）持续存在且整体生理散热反应仍然完全参与的情况下，强化宿主内部防御机制以对抗热应激的细胞攻击的作用。先前的研究表明，热应激会增加胰岛素，进而抑制脂肪分解并减少脂质动员。为了补偿随之而来的能量亏缺，肌肉蛋白质被分解以释放支链氨基酸（BCAAs），如缬氨酸和异亮氨酸。这些BCAAs随后在肝脏中通过支链氨基酸转氨酶（BCAT）和支链α-酮酸脱氢酶（BCKDH）进行代谢。这个过程驱动脱氨基途径——亮氨酸→异戊酰辅酶A→3-甲基巴豆酰辅酶A→乙酰辅酶A，以及缬氨酸→琥珀酰辅酶A——从而为三羧酸（TCA）循环提供底物并维持能量生产。在本研究中，BCAA衍生的酰基甘氨酸——N-乙酰缬氨酸、异丁酰甘氨酸和2-甲基丁酰甘氨酸（2-MBG）——连同羟苯乙酰甘氨酸、3-甲基胸腺嘧啶（3-MT）和百里香酚硫酸酯，均显著升高。酰基甘氨酸的积累表明肝细胞解毒功能受损，最可能的原因是甘氨酸N-酰基转移酶（GLYAT）的氧化抑制；这种抑制反映了肝功能障碍和加速的肌肉蛋白质分解。2-MBG升高进一步表明异亮氨酸分解代谢中断，这可能会减少TCA循环通量和ATP合成。检测到百里香酚硫酸酯（百里香酚的II相结合物）提供了母体化合物体内抗氧化和抗炎活性的间接指标。这些改变强调了热应激下的代谢恶性循环：BCKDH抑制阻断了BCAA氧化为琥珀酰辅酶A，减少了TCA循环的进入并导致中间体积累。同时，氧化应激消耗了半胱氨酸，这是谷胱甘肽（GSH）合成的限速前体， perpetuating the cycle: 能量亏缺驱动BCAA分解代谢；BCAA耗竭损害GSH合成；减弱的抗氧化防御加剧线粒体损伤和ROS生成；能量代谢进一步受损。在H-OEO中，胆汁酸相关化合物——甘氨脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸和胆酰丙氨酸——与BCAA衍生代谢物一起显著上调。甘氨脱氧胆酸是一种次级胆汁酸，通过FXR–FGF19途径控制脂质代谢和胆汁酸稳态，但在急性胰腺炎等情况下可能发挥促炎作用。牛磺鹅脱氧胆酸通过上调SRSF9和增强糖皮质激素受体（GR）信号传导表现出抗炎和免疫调节活性。胆酰丙氨酸是一种结合胆汁酸，可能调节核受体活性并重塑肠道微生物群。KEGG富集分析虽然未识别出任何单一显著改变的通路，但提供了一个重要的系统视角。缺乏明显失调的通路表明OEO不像靶向药物那样阻断特定的酶促反应。相反，其在热应激牛中的补充促进了跨越多个通路边界的全局代谢再平衡。这一发现与植物精油的已知多效性完全一致。OEO的成分，特别是百里香酚和香芹酚，可能对多个细胞靶点（包括膜完整性、酶活性和信号转导）施加微妙的调节作用，这些作用共同表现为观察到的肝脏健康、抗氧化状态和免疫功能的改善。这种作用机制最好描述为“系统水平稳定化”而非“通路特异性干预”。总的来说，我们的数据表明，牛至精油（OEO）显著重塑了热应激平南牛的代谢。通过加速支链氨基酸（BCAA）分解代谢，补充剂部分抵消了能量亏缺；然而，伴随的支链α-酮酸脱氢酶（BCKDH）抑制导致中间代谢物积累并加剧氧化损伤。此外，高剂量OEO激活胆汁酸代谢，可能在热应激期间提供替代能源。反刍动物瘤胃和肠道微生物群落形成一个复杂且高度整合的生态系统，在营养代谢、免疫防御、发育调节和环境适应中起着至关重要的作用。在本研究中，在门水平上，只有疣微菌门（Verrucomicrobiota）在治疗动物的肠道中显示出丰度显著降低。该门的代表性物种阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）以粘蛋白作为其唯一的碳源和氮源，通过分泌糖苷水解酶、硫酸酯酶和碳水化合物酯酶来降解粘蛋白。其丰度下降可能归因于牛至精油诱导的细胞包膜崩解，因为百里香酚和香芹酚插入脂质双层并破坏膜完整性，从而减少了疣微菌门（Verrucomicrobiota）的数量。在瘤胃中，补充富集了拟杆菌门（Bacteroidota）和纤维杆菌门（Fibrobacterota），同时抑制了厚壁菌门A（Firmicutes_A）。拟杆菌门（Bacteroidota）驱动多糖（纤维素、淀粉）降解，其扩张可能改善了日粮能量获取。纤维杆菌门（Fibrobacterota）是主要的纤维素分解瘤胃类群，直接提高了饲料转化率。厚壁菌门A（Firmicutes_A）拥有许多糖苷水解酶和糖转运蛋白（例如毛螺菌科Lachnospiraceae），可切割复杂多糖并输入单糖；因此，其减少可能会降低肠道碳水化合物吸收效率。在属水平上，只有低剂量OEO增加了肠道隐杆菌属（Cryptobacteroides）。该属成员编码广泛的碳水化合物活性酶（CAZymes），靶向复杂的半纤维素，意味着从日粮中改善了能量获取。在瘤胃中，相同剂量提高了普雷沃菌属（Prevotella），同时抑制了Sodaliphilus和隐杆菌属（Cryptobacteroides）。尽管普雷沃菌属（Prevotella）水解纤维素和蛋白质，但其过度生长会增加瘤胃氨氮。这些剂量依赖性转变强调了OEO对微生物功能和宿主代谢稳态的微调。隐杆菌属（Cryptobacteroides）和Sodaliphilus都拥有广泛的多糖利用位点（PULs），可将复杂多糖切割成简单糖，
