梨叶片黄化转绿过程中DYW型PPR基因家族的全基因组鉴定及动态转录组分析揭示PpMYB102-PpPPR115调控新模块

《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide identification and dynamic transcriptome profiling of the DYW-type PPR family across greening of chlorotic leaves in pear (Pyrus pyrifolia)

本研究通过全基因组鉴定梨中129个DYW型PPR蛋白，结合高深度重测序与多时期叶片转录组分析，系统揭示了该家族在梨叶片黄化转绿过程中的结构变异与动态表达模式。研究发现，关键基因PpPPR115的表达与叶绿体发育及光合作用密切相关，并受上游转录因子PpMYB102直接调控，为解析梨叶片黄化机理提供了新的调控通路（PpMYB102-PpPPR115模块）和潜在靶点。

　　

引言

梨（Pyrus pyrifolia）黄化叶片严重损害光合作用及光合产物的积累，其主要原因在于叶绿体发育异常。DYW型PPR蛋白在调控叶绿体发育和维持结构完整性中扮演关键角色。为全面解析DYW型PPR蛋白在梨叶片及叶绿体发育中的作用，本研究对梨中129个DYW型PPR蛋白进行了全基因组鉴定，并系统分析了其序列多样性、蛋白结构域及进化关系。

材料与方法

以‘初夏绿’梨（CL）及其芽变材料（CM）为研究对象，在叶片伸展后第6、12、18、24、30天（分别对应S1-S5阶段）取样。通过测定叶绿素含量、铁离子（Fe²⁺）含量及透射电镜观察叶绿体超微结构，明确CM叶片的生理特征。利用隐马尔可夫模型（HMM）鉴定梨基因组中DYW型PPR家族成员，构建系统进化树，分析基因结构、保守域及启动子顺式作用元件。通过全基因组重测序（50x深度）检测CL与CM间的结构变异（SNPs/InDels）。基于RNA-seq数据分析DYW型PPR基因在五个发育阶段的表达模式，利用STRING数据库构建蛋白互作网络（PPI），并进行GO功能富集分析。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选关键模块，采用双荧光素酶报告基因实验和酵母单杂交验证PpMYB102对PpPPR115的转录调控作用。

结果

3.1 ‘初夏绿’梨及其芽变材料的生理形态与指标分析

与CL相比，CM叶片在S1-S3阶段叶绿素a含量显著降低，S4-S5阶段逐渐回升；叶绿素b含量差异不显著。Fe²⁺含量在CM中持续低于CL，但随发育进程逐步增加。透射电镜显示，CL在S1、S3、S5时期叶绿体结构正常且可见淀粉粒；CM在S1和S3时期叶绿体发育不良，无淀粉粒，至S5时期结构有所恢复。

3.2 梨DYW型PPR基因家族的鉴定

共鉴定出129个含典型DYW结构域的PPR基因，分布于17条染色体上。系统进化树显示部分基因对（如PpPPR35/PpPPR36）具有高bootstrap值，提示其可能源于共同进化事件。蛋白等电点（pI）为5.57-9.04，分子量（MW）为24987-174574 Da，其中70.54%的基因定位于叶绿体。

3.3 基因结构、保守域及启动子 motif 分析

基因结构分析显示多数成员含短内含子或无内含子。MEME预测到10个保守基序，其中Motif 10含“DYW”结构域，存在于所有成员中。启动子分析发现脱落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件在93.8%的成员中富集。

3.4 种内共线性与进化分析

共检测到25个共线性事件，涉及47个基因，其中92%为染色体间共线性。Ka/Ks值在0.12-0.64之间，表明该家族主要受纯化选择。

3.5 与梨叶片黄化相关的DYW型PPR基因结构变异分析

重测序鉴定出14,402个SNPs和2,196个InDels。其中33个SNPs和4个InDels分布于9个DYW型PPR基因，以PpPPR75和PpPPR92变异最为显著。

3.6 DYW型PPR基因表达模式及蛋白互作网络

表达谱分析发现6个差异表达基因：PpPPR2、PpPPR60和PpPPR115在CM早期下调；PpPPR35、PpPPR91和PpPPR97在CM早期上调。PPI网络显示这些基因与MORF家族、NDH复合体成员互作，GO富集分析表明其功能涉及叶绿体发育、RNA编辑、光合作用及植物激素响应。

3.7 加权基因共表达网络构建

WGCNA将31237个基因划分为28个模块，117个DYW型PPR基因分布于12个模块中。黑色模块基因在CL早期高表达，可能与CM早期黄化相关。以PpPPR115为核心的共表达网络（51个基因）显著富集于光合作用、光系统I电子传递等过程。

3.8 PpPPR115的转录调控分析

qPCR验证PpPPR115在CM早期表达显著下调。启动子分析发现两个MYB结合位点，表达谱筛选出12个差异表达MYB基因。双荧光素酶和酵母单杂交实验证实PpMYB102可直接结合PpPPR115启动子并激活其转录。

讨论

全基因组分析为解析基因家族的结构与功能提供了全局视角。本研究发现梨DYW型PPR家族成员在蛋白结构上存在异质性，部分成员虽含非典型DYW域，但可能通过招募标准DYW域发挥RNA编辑功能。蛋白互作网络提示DYW型PPR蛋白可能与MORF家族、NDH复合体协同调控叶绿体发育。共表达网络分析凸显了PpPPR115在光合作用相关通路中的核心地位。上游调控实验证实PpMYB102是PpPPR115的正向调节因子，二者构成的调控模块为阐明梨叶片黄化转绿的分子机制提供了新线索。