《Frontiers in Molecular Biosciences》：Bioenergetic and immunological characterization of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from blood and buffy coat
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本文系统评估了从全血和血沉棕黄层分离的外周血单个核细胞（PBMCs）在6个月冷冻保存期内生物能量学功能和免疫特性的变化。研究发现，尽管细胞凋亡增加且免疫反应增强，但线粒体功能参数（ATP水平、柠檬酸合酶（CS）活性及呼吸链复合体功能）保持稳定。该研究为多中心研究中利用冷冻PBMCs评估线粒体功能障碍（MD）和免疫衰老（inflammaging）提供了可靠方法学依据，对衰老及年龄相关疾病研究具有重要意义。
背景
线粒体功能障碍（MD）和免疫衰老是非传染性疾病及衰老过程的标志性特征。外周血单个核细胞（PBMCs）作为评估生理病理状态的微创手段备受关注，但其新鲜状态检测的要求，尤其对多中心研究构成挑战。为此，本研究旨在探索从全血和血沉棕黄层（BC）分离的PBMCs在6个月冷冻保存期内线粒体功能和免疫特性的变化，以建立冷冻样本中线粒体功能障碍的评估方案。
方法
研究采用密度梯度离心法从全血和血沉棕黄层分离PBMCs，并使用胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）作为冷冻保护剂在液氮中保存。通过比较冷冻与新鲜分离的细胞，系统评估了6个月储存期内细胞计数与活力、线粒体呼吸功能、三磷酸腺苷（ATP）产量及柠檬酸合酶（CS）活性。利用流式细胞术分析细胞组成，并通过植物血凝素（PHA）刺激后检测白细胞介素-6（IL-6）、IL-10和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子水平，以评估免疫状态。
结果
细胞恢复与组成分析显示，全血来源的PBMCs在冷冻保存1、3、6个月后活细胞回收率均高于90%，符合功能分析标准。然而，流式细胞术揭示，血沉棕黄层来源的PBMCs在冷冻后凋亡细胞比例显著增加，且CD14/CD16阳性细胞比例发生变化。值得注意的是，所有细胞亚群（包括CD45、CD3、CD19、CD14等）的凋亡率均呈一致性上升，表明冷冻过程本身而非保存时间主导了这一变化。
生物能量学参数测量表明，无论是全血还是血沉棕黄层来源的PBMCs，其ATP水平、CS活性及呼吸链复合体（I-IV）功能在6个月内均无统计学显著差异。仅全血来源PBMCs的复合体I泄漏呼吸（LEAK）在3个月和6个月时降低，提示线粒体状态可能更健康。N/NS通量控制比率在两组中均保持稳定，进一步证实冷冻保存对线粒体能量代谢无负面影响。
免疫反应方面，未刺激的PBMCs细胞因子水平无显著变化，但PHA刺激后，冷冻保存3个月和6个月的PBMCs表现出IL-6、IL-10和TNF-α的显著升高。这种免疫敏感化反应可能与细胞膜损伤、信号转导改变或凋亡信号增加有关，且抗炎细胞因子IL-10的相对优势升高可能误导免疫活化状态的解读。
讨论
本研究证实，在严格控定的冷冻保存方案下，PBMCs的生物能量学功能可稳定维持至少6个月，为其在多中心研究中的应用提供了可靠性。然而，免疫反应的增强和凋亡率的上升提示，在涉及免疫激活的实验设计中需谨慎解读数据。细胞亚群比例的变化及残留粒细胞的可能影响，进一步强调了流式细胞术质控的必要性。研究局限性包括全血与血沉棕黄层来源PBMCs的间接比较，以及样本来源群体相对单一（年轻健康志愿者），未来需扩大供体范围以验证普适性。
结论
PBMCs的冷冻保存是一种可靠的样本处理策略，尤其适用于线粒体功能等生物能量学分析。然而，其引发的免疫反应变化和细胞组成改变要求研究者在使用冷冻样本时，必须充分考虑隔离、冷冻、复苏及培养流程的标准化，并在结果阐释中纳入这些影响因素，以确保数据的准确性和可比性。
