《Frontiers in Immunology》：Exosomal ANGPTL2 in cerebrospinal fluid as a novel prognostic biomarker for primary central nervous system lymphoma
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本研究首次揭示脑脊液（CSF）中外泌体源性血管生成素样蛋白2（ANGPTL2）是原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）的独立预后标志物。通过回顾性分析78例患者数据发现，高表达ANGPTL2与较短的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著相关（p<0.01），且在多因素分析中保持独立性。该发现为PCNSL的液体活检提供了新视角，对风险分层和治疗决策具有重要临床意义。
1 引言
原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）是一种罕见且高度侵袭性的结外非霍奇金淋巴瘤（NHL），严格局限于中枢神经系统（CNS），包括脑实质、脊髓、颅神经、软脑膜和玻璃体视网膜结构，无全身受累。尽管化疗有所改进，免疫疗法不断涌现，但PCNSL的预后仍然很差，中位总生存期（OS）不到2年，5年生存率低于40%。复发频繁，难治性疾病的治疗选择有限，这凸显了对指导风险分层和优化临床管理的工具的迫切需求。
除了治疗挑战外，在早期阶段准确评估疾病也很困难。立体定向活检仍然是诊断的金标准，但其固有的手术风险可能影响患者的依从性。辅助性脑脊液（CSF）诊断（例如流式细胞术）进一步受到淋巴细胞产量低和检测灵敏度低的限制。此外，血脑屏障（BBB）限制了基于血清的生物标志物的使用。这些挑战强调了迫切需要微创的预后工具来指导PCNSL患者的风险分层和临床决策。
外泌体是直径30-150纳米的纳米级细胞外囊泡，几乎由所有细胞类型分泌，携带反映其来源细胞生理或病理状态的蛋白质、核酸和脂质。它们在生物体液中的稳定性以及对货物免受酶降解的保护作用，使得外泌体蛋白成为有吸引力的非侵入性生物标志物候选物，特别是在中枢神经系统恶性肿瘤中，因为组织获取有限且基于血清的标志物通常不可靠。利用这一概念，我们之前的蛋白质组学研究发现，与良性CNS疾病患者相比，PCNSL患者脑脊液外泌体中的血管生成素样蛋白2（ANGPTL2）水平显著升高，这表明其存在主动分泌并具有潜在的生物学相关性。
ANGPTL2是一种分泌型糖蛋白，在结构上与血管生成素相关，后者调节血管稳态和血管生成。除了其生理作用外，ANGPTL2还通过慢性炎症信号传导、细胞外基质重塑、促进血管生成和建立免疫抑制微环境，在多种恶性肿瘤中促进肿瘤发生。ANGPTL2表达升高与实体瘤和血液系统癌症中的侵袭性肿瘤行为、转移和不良预后相关。考虑到中枢神经系统的免疫特权环境，这些病理效应可能与PCNSL特别相关，因为在PCNSL中，血管异常和免疫逃避在疾病进展中起着核心作用。
尽管有这些见解，但外泌体ANGPTL2在脑脊液中的预后价值仍未得到探索。考虑到当前PCNSL诊断和预后策略的局限性、外泌体蛋白的稳定性和肿瘤反射性，以及我们之前观察到的脑脊液外泌体ANGPTL2升高，研究其临床相关性是非常必要的。因此，本研究旨在通过将CSF外泌体ANGPTL2的表达与PCNSL患者的生存结局和临床特征相关联，评估其作为一种新型预后生物标志物的价值，从而为风险分层和治疗决策提供信息。
2 材料与方法
2.1 脑脊液样本和患者临床病理资料
在这项回顾性研究中，脑脊液样本收集自2020年5月至2023年9月期间在我们机构新诊断的78例初治PCNSL患者，这些患者具有可用的治疗前CSF样本和完整的随访信息。所有样本均在开始任何抗肿瘤治疗前获取。患者满足以下纳入标准：初始出现CNS或眼部症状，无系统性病变；经全面体格检查和辅助诊断确认，无淋巴/造血组织或神经外器官受累；新诊断、未经治疗的PCNSL。入组需要治疗前影像学和病理学确认。治疗反应通过比较化疗后影像学数据与基线数据来评估。随访截止日期为2025年5月31日。主要终点是无进展生存期（PFS），定义为从诊断到影像学确认的疾病进展或任何原因死亡的时间；以及总生存期（OS），定义为从诊断到任何原因死亡的时间。所有参与者均接受基于大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）的化疗方案。
2.2 外泌体的分离与表征
CSF样本首先进行10分钟离心以去除细胞，随后在4°C下以2,500 × g离心10分钟以去除细胞碎片、凋亡小体和较大颗粒。收集上清液并储存在-80°C用于后续分析。所有样本均采用相同的分析前工作流程处理，以尽量减少变异。对于每个受试者，从固定体积的CSF（1 mL）中分离外泌体，以确保样本间基于体积的标准化。
对于外泌体分离，收集的CSF在4°C下以2,500 × g离心10分钟以去除细胞碎片，然后通过0.22-μm过滤器过滤。上清液与ExoQuick-TC?外泌体沉淀溶液按5:1的体积比混合，并在4°C下孵育过夜。随后将混合物在4°C下以10,000 × g离心1小时，之后收集黄色的外泌体沉淀。使用透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）来确定外泌体的尺寸和形态。通过Western blotting检测外泌体特异性标志物TSG101和与外泌体相关的蛋白标志物CD81的表达来验证外泌体的特征。
2.3 酶联免疫吸附测定
使用人类ANGPTL2 ELISA试剂盒按照制造商的说明书评估脑脊液外泌体ANGPTL2的水平。简而言之，标准品和稀释的样本一式两份分装，每孔100 μL，并在37°C下孵育1小时。吸弃孔内液体后，不洗涤，直接向每孔加入100 μL生物素化的检测抗体工作溶液，然后在37°C下第二次孵育1小时。随后吸弃孔内液体，每孔用300 μL洗涤缓冲液清洗三次。接着，向每孔加入100 μL酶结合物工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。再清洗五次后，向每孔加入90 μL TMB底物，在37°C避光孵育15分钟。加入50 μL终止溶液终止反应，并立即使用酶标仪在450 nm波长下检测吸光度。该测定的分析检测限，根据制造商说明，范围为0.31至20 ng/mL。
2.4 统计分析
使用GraphPad Prism和SPSS Statistics 20进行统计分析。连续变量根据分布正态性（由Shapiro–Wilk检验评估），以均值±标准差或中位数与四分位距表示。分类变量以频数和百分比表示。
组间ANGPTL2水平差异使用Student t检验或Mann–Whitney U检验进行分析。生成Kaplan–Meier生存曲线以评估外泌体ANGPTL2表达与临床结局的关联，并使用对数秩检验评估组间差异。使用单变量Cox比例风险回归模型识别预后因素。在单变量分析中具有统计学意义的变量被纳入多变量Cox回归模型。统计学显著性定义为双侧p < 0.05。
3 结果
3.1 纳入PCNSL患者的临床特征
该回顾性队列连续入组了78例于2020年5月至2023年9月期间在华山医院符合2022年WHO诊断标准的PCNSL患者。队列中位年龄为60岁，男性占主导地位。全面的基线特征，包括美国东部肿瘤协作组（ECOG）体能状态、血清乳酸脱氢酶（LDH）升高、病变定位模式和活检类型，已详细列出。
3.2 PCNSL患者脑脊液来源的细胞外囊泡的形态学和生物化学表征
本研究采用商业外泌体分离试剂盒作为标准操作程序从CSF中分离外泌体。通过TEM、NTA和针对经典外泌体标志物的Western blotting对获得的外泌体进行了表征。
TEM分析显示，CSF来源的外泌体呈现典型的球形形态，具有完整的脂质双分子膜。NTA显示外泌体尺寸分布范围在30至150 nm之间，主峰在80至120 nm之间，证实大多数颗粒落在预期的外泌体尺寸窗口内。Western blotting证实了经典外泌体标志物TSG101和CD81的存在。这些发现共同证实了分离的囊泡符合外泌体的共识标准，适用于后续的生物标志物分析。
3.3 PCNSL患者外泌体ANGPTL2表达的测定
使用酶联免疫吸附测定法对CSF中的外泌体ANGPTL2水平进行定量。外泌体ANGPTL2浓度的中位数为4.410 ng/mL。根据ANGPTL2水平的中位数将患者分为两组：高水平组和低水平组。高水平组的外泌体ANGPTL2水平显著高于低水平组。高水平组和低水平组ANGPTL2患者的基线特征无显著差异。
3.4 ANGPTL2表达与患者生存期的关联
Kaplan–Meier生存分析显示，外泌体ANGPTL2高水平患者的PFS和OS均显著短于低水平患者。基于外泌体ANGPTL2表达的预后分层揭示了临床结局的显著差异。高水平ANGPTL2组的完全缓解率（CR）和总缓解率（OR）显著低于低表达组。高水平ANGPTL2组的中位PFS为3.4个月，而低水平组为24.7个月。高水平组的中位OS为28.4个月，而低水平组在随访期间未达到中位OS。
3.5 高CSF外泌体ANGPTL2水平是PCNSL患者不良预后的独立相关因素
为了识别独立的预后因素，我们进行了综合的单变量和多变量Cox回归分析，纳入了临床病理学和分子特征。在PFS分析中，单变量分析确定了几个显著的预后因素，包括ECOG体能状态、深部脑受累、病变数量、CSF蛋白水平和升高的外泌体ANGPTL2水平。随后的多变量分析确定年龄、病变数量和高外泌体ANGPTL2水平是PFS缩短的独立预测因子。同样，对于OS，单变量分析揭示了年龄、ECOG体能状态、深部脑受累、病变数量和高外泌体ANGPTL2水平与不良OS显著相关。多变量分析显示，年龄和高外泌体ANGPTL2水平仍然是不良OS的显著独立预测因子。
4 讨论
PCNSL是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，局限于CNS，预后差，治疗选择有限。血脑屏障通过阻碍有效的药物递送和限制外周生物标志物的诊断和预后效用，带来了重大的临床挑战。因此，迫切需要可靠的预后生物标志物进行患者分层，以指导个性化治疗策略并改善临床结局。
在本研究中，我们确定了CSF中外泌体ANGPTL2水平升高是PCNSL的一个新型预后生物标志物。高CSF外泌体ANGPTL2水平独立预测了显著更短的PFS和OS，提供了超越年龄、ECOG体能状态和病变数量等常规临床参数的可量化分子指标。
我们的方法通过关注CSF来源的外泌体货物，代表了液体活检在PCNSL中的创新应用。与外周血不同，CSF直接与CNS肿瘤微环境相互作用，绕过了BBB的限制，并提供了对PCNSL病理生物学的分子洞察。将外泌体ANGPTL2确定为预后指标，强调了利用CSF来源的外泌体来阐明驱动疾病侵袭性的肿瘤-宿主相互作用的价值。
当前PCNSL的预后评分系统，包括国际结外淋巴瘤研究组（IELSG）评分和纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）评分，严重依赖于临床和影像学变量。虽然在常规实践中有用，但这些模型缺乏直接的分子生物标志物。重要的是，我们的多变量分析有力地证明，CSF外泌体ANGPTL2水平提供了独立的预后价值，与已建立的临床因素相比表现出优越的判别能力，并能够对患者进行更精确的风险分层。
ANGPTL2通过促进慢性炎症、细胞迁移和侵袭，与其他恶性肿瘤的肿瘤进展有关。尽管我们的数据确立了ANGPTL2表达与PCNSL患者不良预后之间的强关联，但需要机制研究来确定ANGPTL2是否直接驱动恶性表型，包括增殖、迁移和侵袭。未来在PCNSL细胞系中使用功能丧失和功能获得模型的研究对于阐明这些通路至关重要。
本研究有几个局限性。首先，样本量相对较小，反映了PCNSL的罕见性，这可能限制统计功效和普适性。其次，我们仅分析了临床特征，未包括组织病理学或分子肿瘤特征，可能遗漏了额外的预后变量。第三，CSF外泌体ANGPTL2使用基于体积的标准化方法进行定量，虽然实用且临床可解释，但由于样本间外泌体产量的差异可能引入变异性。由于CSF中囊泡丰度低和样本量有限，其他策略（例如标准化为总外泌体蛋白或颗粒数）在技术上仍然具有挑战性，需要进一步验证。第四，尽管所有参与者都接受了基于HD-MTX的骨干方案，但辅助药物、周期数和巩固策略在真实世界实践中可能有所不同。这种治疗异质性和潜在的指征混淆可能影响生存结局，并可能部分导致观察到的基线ANGPTL2与预后之间的关联。值得注意的是，所有CSF样本均在任何抗肿瘤治疗前获取，这降低了治疗后效应直接改变ANGPTL2测量的可能性；然而，不能排除残留混杂。第五，由于腰椎穿刺并非对所有患者都可行或临床适用，并且生存分析需要可靠的随访，可能存在与CSF可用性和随访完整性相关的选择偏倚。最后，这项研究是回顾性和单中心的；需要进行前瞻性、多中心研究来确认其临床效用并确定ANGPTL2测量的最佳阈值。
总之，我们的研究结果表明，升高的CSF外泌体ANGPTL2是PCNSL一个有前景的预后生物标志物。定量CSF外泌体ANGPTL2可能有助于在诊断时识别高风险患者，这些患者可能受益于强化或新型一线治疗，并能够实时监测治疗反应和耐药性。此外，ANGPTL2是一个潜在的治疗靶点。总体而言，测量CSF外泌体ANGPTL2代表了在PCNSL中迈向生物学指导的精准医学的一步，既提供了预后见解，也为未来研究提供了机制方向。
