《Food & Function》：Metabolomic analysis reveals novel ethylated hydroxytyrosol metabolites in colon cancer cells
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本刊推荐：本研究通过体外模拟消化（INFOGEST法）结合非靶向代谢组学（UHPLC-ESI-QTOF-MS）技术，首次在结肠癌细胞（Caco-2）中发现羟基酪醇（HT）的新型乙基化代谢物（如ethoxy phenylacetic acid sulfate）。这些代谢物在健康人群和小鼠血浆中未被检测，提示其可能作为肿瘤特异性生物转化标志物，为结直肠癌的早期诊断提供了新思路。
引言
植物产生多种次生代谢物，其中羟基酪醇（HT）及其衍生物以其抗氧化和化学预防特性著称。HT在膳食摄入后经过广泛的生物转化，最初由肠道微生物群介导。越来越多的证据表明，某些下游产物而非母体分子在哺乳动物细胞中发挥最重要的生物学效应。新型代谢物的识别可能揭示未知的代谢途径，尤其在癌症等病理背景下。本研究通过体外模拟胃肠道消化（INFOGEST法）HT，并研究其在肿瘤代谢活跃的肠道Caco-2细胞中的生物利用度（50 μM HT处理2、4和6小时），进而对上清液进行非靶向代谢组学分析，发现了与对照组相比的新型HT衍生实体。
材料与方法
HT的体外消化采用INFOGEST协议，在模拟唾液、胃和肠液中进行，温度维持在37°C。Caco-2细胞（源自结肠腺癌）用于生物利用度测定，通过MTT法确定非毒性浓度50 μM。HT含量通过HPLC定量，使用C18柱和梯度洗脱程序。细胞培养在Transwell?系统中，测量TEER值以确保上皮单层完整性。血浆样本来自补充HT的健康人类（60 mg/天，28天）和裸鼠（50 mg/kg/天，2个月）。代謝物提取使用乙腈/甲酸混合液，并通过SpeedVac干燥。非靶向代谢组学分析采用UHPLC-ESI-QTOF-MS，负离子模式，数据通过MS-DIAL和MetaboAnalyst处理。靶向分析使用HPLC-DAD-ESI-MS/MS-IT验证新代谢物。
结果
HT浓度在体外消化过程中显著下降，从初始1981 mg/L降至肠道阶段的74 mg/L。多变量分析（PLS-DA）显示HT-硫酸盐（VIP得分3.30）为关键实体，基于模式识别鉴定出106个候选物。最终，9个分子被暂定为HT衍生物，其中4个为首次报道：ethoxy phenylacetic acid sulfate 1（4）、ethoxy phenylacetic acid sulfate 2（5）、ethyl hydroxyphenylacetate sulfate（6）和ethoxy hydroxyphenylacetic acid或ethyl hydroxyphenylacetate glucuronide（9）。MS/MS碎片在20 eV碰撞能量下显示硫酸盐丢失和片段m/z 195.0667，证实乙基化发生在羟基或羧基上。UV光谱分析显示HT-硫酸盐、HVA-硫酸盐和新型代谢物在240 nm有苯环吸收峰，但乙氧基取代导致280 nm波段强度减弱，支持结构差异。HPLC-DAD-ESI-MS/MS-IT进一步验证了碎片模式。然而，这些乙基化代谢物在健康人和小鼠血浆样本中未检测到。
讨论
HT及其代谢物具有潜在生物活性，如抗炎和抗动脉粥样硬化作用。本研究首次报道HT在肿瘤细胞中的乙基化，这可能由酶促过程介导，而非微生物作用，因为体外系统无 microbiota。乙基化可能改变HT的性质，影响癌症生物学，如蛋白质定位或信号通路。代谢组学技术成功揭示了肿瘤特异性代谢改变，但研究局限在于体外条件不能完全模拟体内复杂性，且缺乏体内验证。新型代谢物可能作为结直肠癌的生物标志物，但需进一步研究其在肿瘤患者中的药代动力学和功能。
结论
本研究通过非靶向代谢组学在肿瘤结肠细胞中鉴定出新型乙基化HT代谢物，如ethoxy phenylacetic acid sulfates，这些代谢物在健康血浆中缺失，提示肿瘤特异性生物转化途径。未来研究应聚焦体内验证、酶途径探索及其作为癌症诊断工具的潜力。代谢组学为揭示疾病特异性代谢过程提供了强大工具，有望推动靶向治疗发展。
