《Small》：Renovating Neural Networks With Viral-Mediated Gene Transfer From A Tissue Contacting Matrix Mimic
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本文介绍了一种创新的基因治疗策略，通过将携带脑源性神经营养因子（BDNF）基因的腺相关病毒（AAV-DJ）封装在一种可注射的自组装肽（Fmoc-DDIKVAV）水凝胶中，实现了对神经退行性疾病（如亨廷顿病）的靶向、持续治疗。该水凝胶模拟大脑细胞外基质（ECM），不仅能保护病毒载体免受免疫清除，还能控制其释放，从而在体外和体内模型中显著提高转导效率，促进BDNF表达，并有效保护纹状体神经元免受喹啉酸（QA）诱导的兴奋性毒性损伤，同时减轻神经炎症反应。这一智能递送系统为克服传统神经营养因子疗法半衰期短、扩散受限等挑战提供了新思路。
ABSTRACT
神经退行性疾病，如亨廷顿病（HD），对医疗保健的可及性和成本产生重大影响。HD是一种致命的遗传性疾病，其特征是纹状体神经元进行性丧失，成人脑内缺乏内源性修复能力是其治疗的主要障碍。近年来，通过使用脑源性神经营养因子（BDNF）提供神经营养支持来保护神经回路的研究取得了进展，但由于该蛋白半衰期短（体外<5小时，24小时后几乎检测不到）和扩散有限，效果欠佳。为解决这一问题，腺相关病毒（AAV）载体可被用作递送工具，在空间上转导细胞，实现BDNF的局部生产，从而保护神经元和/或促进可塑性，但AAV本身也存在局限性。为克服AAV基因递送中的已知挑战，本研究制备了一种可注射的、生理稳定的、模拟大脑细胞外基质的水凝胶来封装AAV。这一智能系统既能屏蔽又能约束AAV，从而优化转染效率，并在靶点实现持续且高水平的BDNF表达。在此，我们通过由自组装肽纳米支架形成的水凝胶递送AAVDJ-BDNF，实现了高效的神经保护。这些发现支持了以下观点：通过工程化的生物材料递送系统，实现BDNF向纹状体神经元的时空特异性释放，通过提高针对减缓神经退行性疾病进展的基因治疗疗效，展现了巨大的应用前景。
1 Introduction
许多神经退行性疾病无法治愈，且治疗选择有限。这一问题在神经系统疾病中尤为突出，常导致认知和/或运动功能进行性衰退。对于许多神经退行性疾病，如胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）和脑源性神经营养因子（BDNF）等生长因子已被证明对保护神经元和促进可塑性有益。然而，这些蛋白质的临床递送面临重大挑战，包括：（i）在生理环境中的不稳定性（有证据表明BDNF降解迅速，体外半衰期<5小时，24小时后无法检测）；（ii）难以穿过血脑屏障；以及，在采用输注方法时，还面临（iii）高成本、（iv）脱靶效应、（v）局部创伤和感染，以及（vi）不良免疫反应等额外挑战。
为解决这些挑战，临床前研究日益关注微创策略，以实现生长因子在生理相关浓度下的靶向和长效递送。开发有效的药物/生长因子递送载体，使其能通过单次、明确的注射提供局部、持续的释放，同时保护生长因子免于降解，至关重要。
生长因子递送可以保护并恢复在阿尔茨海默病、帕金森病（PD）和亨廷顿病（HD）等神经退行性疾病中丢失的神经元。HD是一种单基因遗传病，由4号染色体短臂4p16.3上的亨廷顿蛋白（Htt）基因中胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤（CAG）三核苷酸重复序列过度扩增引起，导致功能异常的可变亨廷顿蛋白（mHTT）形成，该蛋白积聚并在神经元内形成毒性聚集体。这导致进行性变性，特别是纹状体和皮质神经元，表现为不自主运动（舞蹈症）、认知能力下降和情绪障碍。虽然FDA批准的药物如丁苯那嗪和氘代丁苯那嗪可缓解舞蹈症，但副作用严重，且未能解决根本病因。临床前和临床研究结果表明，BDNF可通过保护宿主神经元免受退行性过程的影响而为HD带来潜在益处，包括通过病毒递送方式。在此背景下，腺相关病毒（AAV）载体已成为中枢神经系统（CNS）中高效的工具。
基因治疗受益于近期在修饰和突变AAV衣壳方面的进展，衣壳在决定AAV趋向性、转导和靶向特定细胞进行基因递送方面起着关键作用。在我们之前的研究中，我们观察到，在最常用的几种AAV（包括AAV-DJ、AAV-2和AAV-5）中，AAV-DJ在体外（如原代皮质神经元、星形胶质细胞和人星形胶质细胞）和体内实验中均表现出最高的转导效率。AAV-DJ病毒变体是一种生物工程病毒，整合了AAV2、AAV8和AAV9的组件，包含了来自AAV2的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）结合残基。此外，加入来自AAV8和AAV9血清型的衣壳区域增强了该变体与细胞受体和辅助受体的相互作用，从而提高了AAV-DJ对转导细胞的特异性。
尽管取得了这些成就并且出现了多种候选血清型，但基本的限制仍然存在，包括转导效率低、脱靶效应、病毒粒子播散，以及最重要的，宿主免疫系统的中和作用。已有大量尝试致力于通过利用可植入或组织接触性生物材料作为递送载体，来增强病毒载体递送的机制、效率和特异性。
这一进展的一个重要方面将是开发一种组织整合的、非免疫原性的生物材料，然后将其工程化以实现AAV的包载和定量递送，形成一个全面的、组织特异性的、临床适用的“套装”。水凝胶，一类亲水性聚合物网络，在这一领域具有巨大潜力，主要是因为其结构可以通过成熟的化学方法轻易地进行工程化，以表现出与各种组织的细胞外基质（ECM）相似的机械和结构特性。
近年来，自组装肽（SAP）水凝胶在再生医学中展现了潜力，并引起了研究人员的极大兴趣，因为它们可以在生理相关条件下通过生物相关肽序列的自发组装轻松制备。这类水凝胶具有全合成方法的优点，可产生纳米纤维状、多孔结构，同时保持固有的生物相容性，具有可调节的化学和机械特性，且无需溶剂、交联剂或催化剂。
我们课题组先前已工程化出由简约（少于7个氨基酸）肽序列自组装形成的可注射、组织匹配且生物相容的水凝胶。为了启动组装，这些短序列的N端与芴甲氧羰基（Fmoc）芳香族封端基团缀合。在生理条件下，这些肽衍生物利用物理相互作用自组装成纳米级纤维状结构，从而产生高密度、可生物利用的肽表位，促进细胞相互作用。在证明其临床前景的示范中，我们已表明这些Fmoc-SAPs在体内递送时既具有神经保护作用，也具有抗炎作用。为了使水凝胶更适合CNS组织，我们加入了层粘连蛋白中广泛验证的肽表位IKVAV（异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸），这是大脑ECM中一种丰富的蛋白质。这种蛋白质及其表位已被证明在ECM相关功能中发挥重要作用，促进各种神经细胞行为，如粘附、迁移、增殖和分化。然而，其在简约SAPs中的应用受到限制，因为该序列在生理条件下不能组装成所需的纤维状结构。因此，为了使该序列能够在生理pH下组装，在天冬氨酸（D）残基被包含作为SAP的N端残基；引入这些残基是为了修饰肽衍物的pKa，同时确保C端IKVAV序列是可生物利用的。SAPs经历热力学驱动的自组织，稳定在纳米纤维排列中，具有疏水核心（Fmoc），使得溶剂化的C端序列呈现在表面。然后，这些纤维通过表面介导的超分子关联进行纵向排列，通过表面介导的超分子关联将溶剂（任何溶解的成分）包裹在由装饰的相互缠绕的束支撑的、生理稳定的超分子水凝胶中，从而实现互连的纳米纤维网络的形成。
受帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病新型治疗策略开发中关键空白的启发，本研究探索了一种可注射的Fmoc-SAP水凝胶系统在体外和体内维持和控制编码BDNF的病毒载体递送的能力。其结果是一个系统，使得治疗性生长因子可以在不产生副作用或刺激免疫反应的情况下，在变性区域持续存在。
2 Experimental Procedures
2.1 Materials Preparation and Characterization
Fmoc-DDIKVAV肽衍生物的合成采用固相肽合成（SPPS）法在Wang树脂上进行。通过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）分析证实肽的纯度（>94%）和正确分子量（预期980.49 m/z，观测到981.1 m/z）。使用pH切换技术制备Fmoc-DDIKVAV SAP水凝胶。通过Zeta电位测量表面电荷，傅里叶变换红外光谱（FTIR）和圆二色光谱（CD）分析二级结构，证实形成了反平行β-折叠结构。透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和低温扫描电子显微镜（cryoSEM）显示水凝胶形成互连的纳米纤维网络。流变学分析表明水凝胶具有粘弹性，储能模量（G'）高于损耗模量（G''），并且表现出剪切稀化和恢复行为。利用橡胶弹性理论（RET）估算水凝胶的网格尺寸约为20纳米，小于AAV的尺寸（24-26纳米），有利于物理包载和控制释放。
AAV载体（rAAVDJ-CMV-BDNF-P2A-GFP，简称AAVDJ-BDNF）由儿童医学研究所（CMRI）的载体和基因组工程设施（VEGF）生产，最终滴度至少为2.49 × 1013病毒基因组（vg）/mL。
2.2 Release Profiles
将AAVDJ-BDNF与Fmoc-DDIKVAV溶液在凝胶化前按预定比例混合。将形成的SAP-病毒混合物凝胶化并注入96孔板。在不同时间点（1、4、8、24、48、72和120小时）收集上清液，使用qPCR腺相关病毒滴定试剂盒通过定量PCR（qPCR）分析释放的病毒载体数量。释放曲线显示初始有突释，随后在72和120小时达到稳定平台期，表明水凝胶能够实现AAV的持续控制释放。
2.3 Biological Testing in Vitro
从小鼠胚胎（E14.5）分离培养原代皮质神经元（CTX）和外侧节隆起（LGE）/纹状体神经元。细胞培养5天后，用AAVDJ-BDNF以不同的感染复数（MOT：CTX为104vg/细胞，LGE为103vg/细胞）进行转导。通过免疫荧光染色（标记GFP、βIII-Tubulin、MAP2、GABA）和流式细胞术评估转导效率。结果显示，AAVDJ-BDNF能有效转导CTX和LGE神经元，流式细胞术显示GFP阳性细胞比例分别为79.1 ± 5.4% 和 56.6 ± 1.8%。
通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析hBDNF mRNA表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）定量上清液中的BDNF蛋白水平。结果表明，与未转导的对照组相比，转导的CTX和LGE细胞均能显著表达hBDNF mRNA并释放BDNF蛋白。
为了验证从水凝胶中释放后的AAVDJ-BDNF的功能，将收集到的含病毒上清液添加到培养的CTX和LGE神经元上。免疫荧光和流式细胞术分析证实，释放后的病毒在5天内保持了高转导效率，表明水凝胶能维持病毒的活性和功能。
2.4 In Vivo Studies
动物实验获得批准。成年雌性瑞士小鼠分为5组（每组n=5）：QA损伤组；QA + AAV-GFP（空载体）组；QA + SAP-AAV-GFP组；QA + AAV-BDNF组；QA + SAP-AAV-BDNF组。小鼠接受单侧纹状体注射（1 μL）相应的AAV（存在或不存在SAP水凝胶）。13天后，在同一坐标点注射喹啉酸（QA, 60 nmol in 0.5 μL）以在纹状体内产生兴奋毒性损伤和局部炎症反应（模拟HD小鼠模型）。QA注射6周后，处死小鼠，灌流取脑，进行组织学处理。
通过免疫组织化学评估神经保护作用（NeuN染色显示神经元存活）和神经炎症反应（Iba-1染色显示小胶质细胞活化）。使用Cavalieri原理计算纹状体组织萎缩（NeuN阴性区域）体积，并通过ImageJ分析小胶质细胞活化密度。
2.5 Statistical Analysis
使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行统计分析。显著性水平设定为 *p <0.05, p <0.01,p <0.001,***p <0.0001。数据以均值±标准差（SD）表示。
3 Results
3.1 In Vitro AAVDJ-BDNF Transduction on Mouse Primary Cortical Neurons and Striatal Neurons
AAVDJ-BDNF能在体外有效转导小鼠原代皮质神经元（CTX）和纹状体神经元（LGE）。免疫荧光显示转导细胞共表达GFP（AAV报告基因）和神经元标志物（β3-tubulin, MAP2）或纹状体标志物（GABA）。流式细胞术定量显示，在使用的MOT下，CTX和LGE细胞的转导效率分别达到79.1 ± 5.4% 和 56.6 ± 1.8%。
3.2 BDNF Expression Analysis in Cells
RT-PCR分析证实，转导的CTX和LGE细胞表达了hBDNF mRNA，而未转导对照组则无。ELISA结果显示，转导细胞上清液中的BDNF蛋白释放量显著高于对照组（CTX: p<0.0001; LGE: p<0.01），与mRNA表达结果一致。
3.3 Fmoc-DDIKVAV Hydrogel Biomaterial System Characterization
HPLC和MS证实Fmoc-DDIKVAV肽纯度>94%。形成的
