《Advanced Science》：DNA Nanoflower LYTACs Enable Efficient VEGF Degradation and Verteporfin Loading for Combined Therapy of Wet Age-Related Macular Degeneration
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本文报道了一种创新的DNA纳米花（NF）平台，该平台集成了基于适配体的溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）技术，用于湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）的联合治疗。该平台（NF@VER）不仅能通过多价LYTAC单元高效降解血管内皮生长因子（VEGF），抑制病理性脉络膜新生血管（CNV），还可作为载体负载光敏剂维替泊芬（VER），在近红外（NIR）光照射下产生活性氧（ROS），诱导内皮细胞死亡。研究表明，NF@VER在体内外模型中均展现出显著的抗血管生成活性和治疗潜力，同时具有良好的眼内安全性和长期生物相容性，为wAMD提供了一种精准有效的协同治疗新策略。
1 引言
湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）是老年人不可逆视力丧失的主要原因，其特征是病理性脉络膜新生血管（CNV）。血管内皮生长因子（VEGF）是CNV的关键触发因子。当前标准疗法——抗VEGF治疗虽有效，但部分患者反应不佳，且频繁的玻璃体内注射存在安全风险。光动力疗法（PDT）是另一种有效选择，但术后可能引起VEGF反应性升高，导致CNV复发。溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）是一种新兴技术，能通过内体-溶酶体途径降解胞外和膜蛋白。基于适配体的LYTACs因其易于合成、组织穿透性高和具有多价操控潜力而前景广阔，但单价适配体LYTACs的降解效率相对较低。为解决这一问题，本研究设计了一种基于DNA纳米花（NF）的多价LYTAC，其包含大量分别靶向VEGF和胰岛素样生长因子2受体（IGF2R）的适配体单元，同时负载临床使用的光敏剂维替泊芬（VER），形成NF@VER，用于wAMD的联合治疗。
2 结果
2.1 NF@VER的构建与表征
为增强内化效率并实现联合治疗，研究采用滚环扩增（RCA）方法构建了负载VER的多适配体LYTAC纳米花（NF@VER）。表征结果显示，NF成功构建，VER的负载未显著增加颗粒尺寸，颗粒尺寸从124.4 ± 8.3 nm略微增至131.7 ± 12.5 nm。NF和NF@VER的Zeta电位分别为-31.5 ± 0.2 mV和-26.0 ± 0.9 mV，表明纳米颗粒相对稳定。VER的包封效率为33.79 ± 3.14%，负载容量为3.9 ± 0.36%。光谱分析显示VER通过非共价组装（主要是与DNA碱基的π-π嵌入）有效掺入NF。分子动力学模拟进一步验证了VER异构体可通过氢键和π-π堆叠在DNA口袋中形成稳定结合构象。活性氧检测表明，NF@VER在690 nm NIR照射下能产生与游离VER相当的ROS。血清稳定性实验显示NF@VER在48小时内无明显降解。
2.2 NF有效驱动VEGF至溶酶体降解
NF由多个LYTAC功能单元组成，其中IGF2R靶向适配体与细胞膜上的IGF2R结合，促进VEGF的内吞和溶酶体降解。细胞摄取实验显示，Cy3标记的NF在37°C下能被EA.hy926内皮细胞有效内化。酶联免疫吸附试验表明，NF处理以剂量依赖性方式显著降低VEGF水平，而VEGF适配体、IGF2R适配体或乱序NF对照组则无此效果。此外，NF介导的VEGF降解还导致下游磷酸化AKT水平显著降低。共聚焦显微镜图像显示NF与溶酶体存在共定位，且溶酶体途径抑制剂氯喹和巴弗洛霉素A1能显著抑制NF介导的VEGF降解，而蛋白酶体抑制剂MG132则无此作用，证明NF通过溶酶体途径促进VEGF降解。
2.3 NF@VER在NIR照射下诱导ROS产生和内皮细胞死亡
研究进一步探讨了NF@VER在ROS介导的内皮细胞死亡中的作用。细胞活性实验确定4分钟NIR照射为后续实验条件。VER的最小有效浓度为500 nM。荧光图像显示NF@VER能有效内化到内皮细胞中并与线粒体共定位。流式细胞术分析证实，经NIR照射后，VER或NF@VER处理组细胞内ROS水平显著升高。线粒体膜电位检测探针TMRE的荧光信号在VER或NF@VER加NIR照射组显著降低，表明线粒体损伤。活-死细胞染色证实VER或NF@VER在NIR下能有效诱导细胞死亡。CCK-8实验表明，无NIR时NF@VER不影响细胞活力，但在NIR照射下呈现剂量依赖性细胞杀伤作用。
2.4 NF@VER在体外表现出显著的抗血管生成活性
伤口愈合和Transwell实验表明，VER加NIR照射以及NF或NF@VER单独处理均能显著抑制内皮细胞迁移，且NIR照射增强了NF@VER的抗迁移能力。同样，NF或NF@VER处理显著抑制内皮细胞管状结构形成，NIR照射加剧了NF@VER的抑制作用。进一步的3D球体细胞出芽实验也证实了NF@VER在新生血管形成中的显著作用。这些结果表明NF@VER通过消耗VEGF联合PDT发挥抗血管生成作用。
2.5 NF抑制体内VEGF诱导的血管渗漏
在VEGF诱导的视网膜血管渗漏模型中，眼底荧光血管造影和FITC-葡聚糖灌注实验均显示，NF能有效抑制VEGF诱导的血管渗漏，效果与康柏西普相当。
2.6 NF@VER减轻实验性CNV
在激光诱导的CNV小鼠模型中，体内成像显示玻璃体内注射的Cy5标记NF@VER能在眼内稳定存在72小时，并与内皮细胞标志物CD31共定位于CNV区域。眼底荧光血管造影显示，NF@VER加NIR照射处理能明显减少渗漏面积，治疗效果与康柏西普相当。视网膜色素上皮-脉络膜辅片免疫荧光染色显示，NF@VER加NIR照射导致CNV几乎完全闭塞。此外，NF能有效降解VEGF并降低磷酸化AKT水平。
2.7 NF@VER的长期眼内安全性和全身免疫原性评估
生物安全性评估显示，所有处理组小鼠的角膜、晶状体或视网膜组织均未见明显异常。主要器官H&E染色在治疗14天后未见明显损伤。延长观察至30天，视网膜切片中未检测到Cy5信号，表明NF@VER已被清除。眼组织H&E染色未见明显变化，血清和视网膜-脉络膜复合物中炎症因子IL-6和TNF-α水平未受NF@VER影响，表明NF@VER具有长期安全性。
3 讨论
VER的疏水性及其全身给药引起的副作用长期限制了其应用。本研究开发的集成NF策略能有效阻断VEGF通路并负载VER进行PDT。亲水性NF不仅解决了疏水光敏剂的溶解性问题，还增强了VER的靶向递送效率。PDT相关的另一个问题是其耗氧特性可能导致缺氧诱导的VEGF上调，进而引起CNV复发和治疗失败。本研究证明NF@VER能有效降解VEGF，这可能弥补PDT的VEGF反馈问题，实现全面的CNV治疗效果。
4 实验部分
（此部分详细描述了细胞培养、NF和NF@VER的合成、分子对接与模拟、表征、ROS检测、摄取、ELISA、活细胞成像、细胞活力、线粒体膜电位、免疫印迹、伤口愈合、管形成、Transwell、3D出芽实验、动物实验、FFA、血管渗漏模型、CNV模型、免疫荧光、血管渗漏和灌注分析、H&E染色及统计分析等方法，为研究结果提供了坚实的实验基础。）
作者贡献与致谢
（明确了各位作者的具体贡献以及项目资助来源。）
利益冲突与数据可用性
（声明无利益冲突，并说明研究数据可在论文正文或补充文件中获取。）
