RIG-I介导的神经元特异性I型干扰素信号通路在FUS-ALS中诱导神经退行性变并为个体化治疗提供新靶点

《Advanced Science》：RIG-I Mediated Neuron-Specific IFN Type 1 Signaling in FUS-ALS Induces Neurodegeneration and Offers New Biomarker-Driven Individualized Treatment Options for (FUS-)ALS

本文揭示了FUS-ALS中由RIG-I（Retinoic acid-inducible gene I）介导的神经元特异性I型干扰素（IFN-1）信号通路激活新机制。研究发现FUS突变运动神经元中胞质双链RNA（dsRNA）积累触发RIG-I/TBK1/IRF3通路，导致干扰素刺激基因（ISG）上调及轴突变性。JAK-STAT抑制剂鲁索替尼可逆转该表型，患者外周血中干扰素特征评分与疾病进展相关。该研究为FUS-ALS提供了新型生物标志物驱动的个体化治疗策略。

　　

1 引言

肌萎缩侧索硬化症（ALS）作为一种毁灭性神经退行性疾病，其选择性运动神经元退行的具体病理机制尚未完全阐明。近年研究发现先天免疫通路在ALS模型中被激活，其中cGAS-STING通路可因慢性DNA损伤和线粒体功能障碍导致的胞质DNA积累而激活。本研究聚焦FUS-ALS中的先天免疫通路，发现FUS^mutiPSC来源脊髓运动神经元（sMNs）中干扰素刺激基因（ISG）上调和TBK1-IRF3通路激活。

2 结果

2.1 iPSC来源FUS^mut运动神经元中I型干扰素反应激活

通过RT-qPCR检测发现，FUS-P525L突变sMNs中多种ISG显著上调。Western blot显示突变神经元中TBK1 Ser172磷酸化水平升高，表明TBK1-IRF3通路激活。同时发现突变神经元中IRF3蛋白表达增加，但STING蛋白水平无显著差异。在KOLF P525L-het hNIL-sMN模型中也验证了上述表型。

2.2 FUS突变运动神经元的IFN-1反应独立于DNA损伤和STING信号

使用依托泊苷诱导DNA损伤或PARP抑制剂ABT888处理，均未引起ISG表达变化。STING抑制剂H151处理亦未能降低突变神经元中的ISG水平，提示FUS-ALS中IFN-1通路激活不依赖于DNA损伤和STING信号。

2.3 FUS^mut运动神经元中胞质dsRNA增加

超分辨率显微镜观察发现，FUS突变神经元中线粒体内外dsRNA信号均显著增加。免疫荧光显示约45%的FUS-GFP颗粒与应激颗粒标记物G3BP1共定位，且突变神经元中dsRNA阳性颗粒数量更多。通过线粒体标记HSP60区分发现，游离胞质中的dsRNA在突变神经元中明显升高。

2.4 ISG激活由RIG-I信号介导

Western blot检测到FUS突变神经元中RIG-I蛋白表达升高，而MDA5未检测到明显信号。siRNA敲低RIG-I可显著降低ISG表达水平。免疫组化显示FUS-ALS患者脊髓运动神经元中RIG-I表达明显增加。这些结果证实RIG-I是FUS-ALS中ISG激活的关键介质。

3 FUS患者尸检脊髓运动神经元中RIG-I增加

对FUS-ALS患者脊髓组织切片进行免疫组化分析，发现患者α运动神经元中RIG-I染色强度显著高于健康对照。定量分析显示大多数患者运动神经元存在RIG-I沉积。

3.1 JAK抑制可减轻轴突损伤

使用JAK抑制剂鲁索替尼处理FUS突变神经元7天后，轴突生长面积显著恢复。培养基中神经丝轻链（NfL）水平检测显示，鲁索替尼处理可降低突变神经元的NfL释放量。同时，鲁索替尼处理能显著降低突变神经元中的ISG表达。

3.2 轴突FUS-P525L-sMN样本中线粒体转录上调

RNA测序分析发现，FUS突变神经元轴突样本中线粒体转录相关基因富集。使用线粒体RNA聚合酶（POLRMT）抑制剂IMT1处理可剂量依赖性降低ISG表达，且能减少线粒体mRNA转录本。这表明线粒体转录增加是dsRNA积累的重要原因。

3.3 FUS-ALS患者外周血中发现IFN1激活

对18例FUS-ALS患者外周血进行干扰素特征评分（ISS）分析，发现44.4%的患者ISS升高。ISS与疾病进展速度（Δ-ALSFRS-R）和病程持续时间呈负相关。C末端突变携带者中ISS升高比例更高。

4 讨论

本研究首次揭示FUS-ALS中存在RIG-I介导的神经元特异性IFN-1信号通路激活。机制上，线粒体转录增加导致dsRNA积累，激活RIG-I/TBK1/IRF3通路，进而引起轴突变性。JAK抑制剂鲁索替尼能逆转该表型，患者外周血ISS与疾病严重程度相关。这些发现为FUS-ALS的个体化治疗提供了新靶点和生物标志物策略。

5 方法

5.1 性别作为生物学变量

研究纳入的细胞系、尸检组织和患者血液均包含两性样本，尸检分析采用性别匹配对照。

5.2 细胞培养

使用iPSC来源脊髓运动神经元，通过微流体室培养进行轴突分离分析。细胞定期进行支原体检测。

5.3 患者特征

18例FUS-ALS患者平均年龄47岁，男女比例0.44，所有程序符合赫尔辛基公约并经伦理委员会批准。

5.4 处理与siRNA

使用依托泊苷、ABT888、干扰素-β、鲁索替尼、H151、IMT1等化合物处理细胞，采用siRNA敲低RIG-I表达。

5.5 显微镜与免疫荧光

使用Zeiss LSM 900显微镜进行免疫荧光分析，通过Fiji软件进行图像分割和定量。

5.6 图像分析

使用Labkit插件进行图像分割，通过逻辑运算符区分线粒体内外dsRNA信号。

5.7 统计学分析

使用GraphPad Prism 10进行统计分析，^p< 0.05，^p< 0.01，^p< 0.001，**^p< 0.0001。

5.8 Western blot

使用Li-COR ODYSSEY XF分析仪检测蛋白表达，通过Empiria Studio软件进行定量分析。

5.9 定量RT-PCR

通过LightCycler 480 II系统进行基因表达分析，ISS计算采用既往建立的方法。

5.10 上清液神经丝蛋白检测

使用Ella微流体系统检测培养基中NfL水平。

5.11 尸检组织分析

获取ALS患者脊髓组织，通过免疫组化分析RIG-I表达。

5.12 RNA测序与分析

使用DESeq2进行差异表达分析，STRING数据库构建蛋白互作网络。

5.13 细胞类型分析

通过热图可视化细胞类型特异性标记基因表达。