《Journal of Hazardous Materials》：Chronic Co-exposure to BPA and Alcohol Synergizes Hepatotoxicity via Dysregulation of Glycerolipid Metabolism and Ceramide/HtrA2-Driven Apoptosis in HepG2 Cells
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协同暴露下双酚A与酒精的肝毒性机制及临床意义。采用2D和3D肝细胞球模型揭示其通过LIPIN介导的甘油脂代谢紊乱、HtrA2通路激活及ceramide代谢异常增强氧化应激、凋亡和脂毒性，为多因素暴露风险评估提供新依据。
严秦坦|施家龙|陈一佳|李胜翰|杨志瑞|郭灿燕|邱逸秀
广东省/珠海市IRADS重点实验室及食品科学与技术项目，北京师范大学-香港浸会大学，珠海519087，中国
摘要
双酚A（BPA）和酒精（ALC）被认为是具有肝毒性的物质，人类通过环境来源、饮食习惯以及对酒精饮料的偏好长期暴露于这些物质中。然而，目前尚缺乏关于同时暴露时这两种物质所产生的协同肝毒性效应的确切证据。本研究利用急性及慢性2D模型和3D HepG2/LX-2球状细胞模型，揭示了BPA和ALC共同暴露引起的亚细胞变化，这些变化模拟了肝毒性。结果表明，共同暴露会加剧氧化应激、DNA损伤和细胞凋亡，同时促进脂滴的积累，从而表现出协同的肝脂毒性。这些发现在一个生理相关的3D HepG2/LX-2共培养球状细胞模型中得到了验证，该模型显示共同暴露比单独暴露具有更强的细胞毒性。从机制上讲，长期共同暴露通过协同诱导LIPIN-2和LIPIN-3的表达，特异性地扰乱了LIPIN介导的甘油脂质稳态。此外，整合的转录组学和脂质组学分析表明，在BPA和ALC长期共同暴露的条件下，神经酰胺代谢途径在触发高温依赖性A2（HtrA2）介导的细胞凋亡和致癌信号传导中起着独特作用。重要的是，体外致癌转化实验表明，共同暴露是一种肿瘤促进因素，显著增强了3-MCA诱导的细胞群形成。TIMER数据库分析进一步将异常的HTRA2表达与肝细胞癌（HCC）的发展和不良预后相关联，这可能是由于解毒酶UDP-葡萄糖醛酸转移酶家族2成员B10（UGT2B10）的下调所致，而该酶对正常肝细胞功能至关重要。总体而言，本研究确定了甘油脂质代谢和HtrA2作为协同肝损伤和进一步肝癌发生的早期生物标志物，突显了化学物质与行为因素共同暴露对食品安全和风险评估的重要意义。
引言
长期饮酒（乙醇）是一个由社会和文化因素塑造的全球性公共卫生问题。它在日常生活中根深蒂固，普遍存在于各种社交聚会、庆祝活动甚至宗教仪式中。饮酒行为从适度的偶尔饮用到大量的阶段性饮酒都有。这些行为导致了酒精使用障碍（AUD）的惊人增长[1]，许多患者同时伴有代谢或肝脏相关并发症。过去的研究表明，饮酒会增加患肝癌的风险，即使适量饮酒也可能构成威胁[2]。肝细胞癌（HCC）是一种主要的肝脏恶性肿瘤，通常与脂肪性肝病（SLD）相关[3]。从肝脂肪变性进展为HCC的关键机制是肝脂毒性[4]，这是由于脂质代谢失调引起的。SLD被认为是一种与多种病因因素相关的常见病理学状况。主要的致病因素包括过量饮酒（酒精性肝病，ALD）、代谢功能障碍（非酒精性脂肪肝病/代谢相关脂肪肝病，NAFLD/MAFLD），以及环境毒素的暴露（毒素相关脂肪肝病，TAFLD）[5]，[6]。在代谢综合征患者中，肝脂毒性也常与过量饮酒相关[7]，这些因素的共存越来越与严重的酒精性脂肪肝病（AFLD）相关，这已成为一个日益严重的临床问题。虽然长期饮酒是ALD或AFLD的主要致病因素，但越来越多的证据表明环境因素在肝损伤进展中也起着重要作用。
与饮酒趋势并行的是双酚A（BPA）的广泛存在，BPA常用于生产聚碳酸酯塑料、聚合物材料和环氧树脂[8]。作为一种内分泌干扰化学物质（EDC），BPA也被认为是一个重要的环境风险因素，会促进肝脏疾病的发展[9]。它广泛应用于各种消费品中，包括食品容器、水瓶、热敏纸和医疗设备，并通过渗漏过程进入土壤和水环境中[10]。由于其广泛应用，人类在日常生活中可能会接触到BPA，已有超过90%的人口体内检测到BPA[11]，[12]。普通人群主要通过摄入、皮肤接触和吸入途径暴露于BPA，全球估计成人的每日摄入量为30-70 ng/kg体重[13]，[14]，[15]，[16]。基于人类尿液排泄数据和废水流行病学（WBE）的研究报告称，全球平均每人每日BPA摄入量为2.53 μg/p/day[17]。欧洲的生物监测研究显示92%的成年人体内可检测到BPA，欧洲的调查（HBM4EU项目）记录显示70-100%的参与者超过了欧洲食品安全局（EFSA）在2015年设定的新降低的每日可容忍摄入量（TDI）（4 μg/kg体重/天）[17]。为了确保食品接触材料的安全性，EFSA最近将BPA的TDI定为0.2 ng/kg体重/天[18]。EFSA还指出，BPA的普遍和频繁暴露可能对人类健康造成额外风险，需要进一步严格研究[19]，[20]。鉴于东亚和西方人群中普遍的饮酒模式，来自受污染的饮食来源的BPA与习惯性饮酒中的乙醇的共同暴露构成了一个合理且日益重要的风险情景。了解社会文化饮酒模式与环境化学物质暴露之间的相互作用对于制定全面的风险评估和有针对性的公共卫生干预措施至关重要。
酒精（ALC）被国际癌症研究机构（IARC）归类为1类致癌物，仍然是导致肝脏相关疾病和死亡的主要行为风险因素[21]。BPA具有雌激素和抗雄激素特性，因此会对多种生理组织和器官造成显著损害，尤其是参与生殖、免疫、神经内分泌和代谢系统的组织[16]，[22]。独立的毒理学证据也表明，ALC和BPA通过重叠的机制（如细胞凋亡诱导、氧化应激、线粒体功能障碍、脂质失调和炎症信号传导）引发肝毒性效应[23]，[24]，[25]，[26]，[27]，从而加速SLD的进展。尽管这些机制有共同点，但生活方式和环境因素相互作用导致的潜在协同肝毒性仍不明确。因此，本研究旨在提供BPA/ALC共同暴露的机制见解，具体描述了模拟潜在肝毒性的肝脏功能障碍相关的亚细胞变化。为此，在一个生理相关的3D HepG2/LX-2球状细胞系统中建立了急性和慢性细胞共同暴露模型，以阐明这种协同作用的机制。此外，还进行了转录组学和脂质组学分析，以及体外致癌转化实验，以确定共同暴露所驱动的具体代谢失调和致癌潜力。本研究首次全面识别了与肝脂毒性相关的关键分子信号，提出了一个明确的共同暴露阈值，并阐明了HCC发展的早期生物标志物，为食品安全政策和公共卫生风险评估提供了宝贵的见解。
部分摘录
细胞培养和试剂
HepG2细胞系在添加了10%胎牛血清（FBS，Gibco，10437028）和1%青霉素-链霉素溶液（Corning，30-002-CI）的DMEM培养基（10-013-CV）中培养，培养条件为37°C和5% CO2的空气环境。双酚A（BPA，CAS 80–05–7，纯度≥99%）、二甲基亚砜（DMSO，CAS 67-68-5，纯度≥99.9%）和纯酒精（ALC，GC级，CAS 64-17-5，纯度≥99.8%）均购自Sigma-Aldrich。BPA和ALC分别溶解在DMSO（D8418）中，并进行无菌双蒸馏处理。
BPA和ALC的长期共同暴露通过增加HepG2细胞中的ROS生成诱导细胞凋亡
使用HepG2细胞评估了BPA（0.1-100 μM）、ALC（80-320 mM）或它们的组合（简称B+A）在短期（24小时）或长期（72小时或9天）暴露下的细胞凋亡效应。细胞活力测定显示，当BPA浓度≥100 μM（图S1A）和ALC浓度≥320 mM（图S1B）时，细胞活力显著下降；而BPA 10 μM + ALC 320 mM的组合在24小时处理后表现出增强的细胞毒性（图S1C）。为了评估亚毒性水平下的长期效应
讨论
饮酒（ALC）是多种癌症的已知风险因素，包括口腔、咽部、喉部、食管、肝脏、结直肠和乳腺癌[68]。流行病学研究表明，癌症风险与每日饮酒量呈线性增加[69]，重度饮酒者的风险比轻度饮酒者（男性每天摄入<24克，女性每天摄入<12克）高出6%[70]。尽管饮酒与癌症发展之间存在明确关联
结论
总之，本研究提供了关于BPA和ALC共同暴露在加剧肝细胞损伤中的作用的新机制见解，强调了氧化应激、脂质代谢和细胞凋亡之间的复杂相互作用。这是首次研究表明LIPIN2/LIPIN3的失调是共同暴露特有的机制，其中LIPIN介导的甘油脂质稳态的破坏导致2D和3D共培养模型中的脂滴积累和潜在的脂毒性。
环境影响
本研究阐明了BPA和酒精长期共同暴露引起的协同肝毒性的机制基础，强调了LIPIN-2/3介导的甘油脂质失调和神经酰胺/HtrA2驱动的细胞凋亡信号传导作为肝脂毒性和肝癌发生的潜在代谢生物标志物。鉴于BPA在环境中的普遍存在，与习惯性饮酒相关的协同肝毒性揭示了当前单一化合物风险评估中的一个关键空白
资助
本研究得到了高雄医科大学（NK113P27）、台湾国家科学技术委员会（NSTC114-2314-B-037-018）、北京师范大学-香港浸会大学（UICR0700101-24 & UICR0200024-25）以及广东省IRADS重点实验室（2022B1212010006）的支持。
CRediT作者贡献声明
施家龙：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、概念构思。严秦坦：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、研究、资金获取、正式分析。李胜翰：研究、正式分析。陈一佳：撰写 – 审稿与编辑、正式分析。郭灿燕：项目管理。杨志瑞：撰写 – 审稿与编辑、正式分析。邱逸秀：撰写 – 初稿撰写、监督、项目管理、资金获取利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢Vijay Pandey博士提供BioRender（BioRender.com）的使用权限，该工具用于制作本手稿中的图形摘要。
