一种来自食品发酵细菌的新型羧酸酯酶Est3617，可快速清除环境和食品中的β-氟氯氰菊酯

《Journal of Hazardous Materials》：A Novel Carboxylesterase Est3617 from a Food-Fermentation Bacterium for Rapid Remediation of β-Cyfluthrin in Environment and Food

吡虫啉降解酯酶基因est3617的功能研究与酶工程应用。通过转录组分析发现Aneurinibacillus aneurinilyticus D-21中est3617基因编码高效降解β-氰氟菊酯的酯酶，该酶具有催化三联体活性位点，在45℃和pH9.0条件下活性最佳，对多种环境介质和果蔬表面吡虫啉残留均表现出显著降解效果（67.02%-81.35% within 60 min）。该研究为开发环境-食品联防的吡虫啉生物降解体系提供了新策略。

　　

黄思琪|唐杰|余轩|彭传宁|文琦|陈思琪|雷兰琪|杨晨曦|刘园曦|向文亮|张青|张梦梅

四川西华大学食品与生物工程学院，中国四川省成都市610039

摘要

拟除虫菊酯类杀虫剂的普遍存在对环境安全和人类健康构成了重大威胁。在本研究中，从传统发酵食品 Pixian 豆酱中分离出的 Aneurinibacillus aneurinilyticus D-21 被证实是一种高效的 β-氰氟氰菊酯（β-CYF）降解菌。在 β-CYF 应激条件下进行的转录组分析发现了一个关键的羧酸酯酶基因 est3617，该基因被克隆并表达在 大肠杆菌 中。纯化的 Est3617 酶含有典型的催化三联体（Ser₉₇-Asp₁₉₃-His₂₂₃），在 45°C 和 pH 9.0 条件下表现出最佳活性，并具有广泛的底物特异性以及在不同温度和 pH 条件下的显著稳定性。重要的是，Est3617 在各种环境基质（水、土壤和沉积物）中均显示出高效的 β-CYF 剩余物降解能力。处理 24 小时后，超过 75% 的 β-CYF 被降解，其半衰期显著缩短至 5.32–8.26 小时。此外，当作为水果和蔬菜的清洁剂使用时，Est3617 在 60 分钟内也能有效去除 β-CYF 剩余物，不同蔬菜类型的降解率达到了 67.02% 至 81.35%。这些结果表明 Est3617 是一种有前景且潜在安全的生物催化剂，为实现从环境到食品的酶促策略以减轻拟除虫菊酯污染提供了可能。

引言

拟除虫菊酯（PYRs）是一种高效的合成杀虫剂，因其广谱效力和快速作用而在农业和家庭环境中得到广泛应用[1]。含有 α-氰基的 II 型拟除虫菊酯具有更强的杀虫效力和更长的残留活性[2]。虽然这些特性有利于害虫控制，但它们在环境中的持久性和高脂溶性引发了对其缓慢降解和对非目标生物潜在毒性的担忧[3]。II 型拟除虫菊酯在环境中的普遍存在导致了多介质污染，这种污染遍布全球的农业、城市和室内环境[4]。这种广泛分布得到了高检测率的证实，例如在中国长江三角洲的农业土壤[1]、巴西的城市大气[5] 和 Mono 河流域的水体[6] 中检测到的比例经常超过 85%。更严重的是，拟除虫菊酯可以被作物吸收并积累在食品中，从而进入人类食物链，引发食品安全问题[7][8]。世界卫生组织（WHO）将 II 型拟除虫菊酯归类为中等危害性物质（II 类）[9]。即使是在低剂量下，长期暴露也与神经毒性、内分泌紊乱和免疫抑制有关，对脆弱人群的风险更大[10][11]。因此，开发有效的修复策略以减轻生态系统和食品中的拟除虫菊酯残留物是一个紧迫的环境挑战。

微生物分解为农药生物修复提供了一种有前景且环保的方法，许多细菌[3][12][13] 和真菌[14][15][16] 能够将拟除虫菊酯水解成毒性较低的化合物，并将其矿化为 CO? 和 H?O。然而，一个关键挑战是，大多数已表征的降解菌来源于严重污染的环境或昆虫肠道。这种特定的生态起源对监管批准构成了重大障碍，限制了它们在食品相关应用中的安全使用[17][18]。相比之下，来自传统食品发酵过程的微生物在安全性方面具有明显优势；例如来自中国砖茶的 Aspergillus niger YAT 和来自 Fu 砖茶的 Eurotium cristatum ET1[19][20]。尽管这些来自食品的微生物是一个有前景但尚未充分探索的资源，但负责其拟除虫菊酯降解活性的酶系统仍很大程度上未知。特别是，负责初始水解步骤的关键羧酸酯酶在这些安全宿主中尚未得到很好的鉴定或表征，这阻碍了高效酶基修复策略的发展。

羧酸酯酶是催化拟除虫菊酯降解的关键酶，通过水解酯键来产生毒性较低的代谢物。作为 α/β-水解酶超家族的成员，这些酶参与酯键的断裂或形成[17]，并在各种工业和环境应用中得到广泛应用，包括药物代谢以及塑料和农药的生物降解[21]。它们的高催化效率和底物特异性使得即使在复杂基质中也能选择性地降解拟除虫菊酯[22]。已经鉴定出许多用于此目的的微生物酯酶，例如来自 Bacillus cereus BCC01 的 EstA[23] 和来自土壤宏基因组的 Est822[24]。然而，尽管在酶表征方面取得了显著进展，但关于其实际应用的研究仍然有限。涉及 Est13 在食品系统中的开创性研究[11] 和 Est816 在农业环境中的研究[25] 强调了酶促修复的潜力，这种修复方法具有操作安全性和副产物生成少的优势[11]。体外表征与实际应用之间的差距强调了寻找新的酶来源的必要性。来自食品级微生物的酶为开发增强食品安全的针对性策略提供了特别有前景和安全的方法。

本研究调查了从发酵食品 Pixian 豆酱中分离出的 Aneurinibacillus aneurinilyticus D-21 对拟除虫菊酯的降解作用。所选的模型农药是 β-氰氟氰菊酯（II 型拟除虫菊酯），这种农药在环境和作物中广泛使用且经常被检测到[4][8][26]。转录组分析确定 est3617 是负责拟除虫菊酯降解的关键基因。该基因在 大肠杆菌 中异源表达，得到的重组酶（Est3617）对 β-CYF 显示出强烈的降解活性。这些发现突显了 Est3617 在模拟环境以及水果和蔬菜中快速生物修复 β-CYF 污染的潜力，为从环境到食品的全面策略以减轻拟除虫菊酯残留物奠定了基础（图 S1）。

化学物质和细菌菌株

本研究中使用的 β-氰氟氰菊酯（纯度 ≥ 98%）购自 Dr Ehrenstorfer?（德国）。高效液相色谱（HPLC）级甲醇和乙腈来自 Thermo Fisher Scientific（上海，中国）。本研究中使用的所有化学物质，包括 NaCl 和 MgSO?，均为分析级。精确称取 1.0 克 β-CYF 并将其溶解在 100 毫升乙腈中，制备浓度为 10 克/升的储备溶液。将其储存在 4°C 的黑暗环境中以备后续使用。

菌株 D-21 对 β-氰氟氰菊酯的降解特性和代谢途径

在添加了 50 毫克/升 β-氰氟氰菊酯的 LB 培养基中监测了菌株 D-21 的降解动力学和生长情况（图 1A）。120 小时内，该菌株降解了 85.57% 的 β-氰氟氰菊酯，使其浓度从 49.75 毫克/升降低到 7.18 毫克/升。降解过程符合伪一级动力学（方程 1），计算出的速率为 0.01907 毫克/小时^-1（方程 2）。相比之下，非生物对照组在同一时间段内仅显示出轻微的下降（7.75 毫克/升），证实了...

结论

本研究调查了 Aneurinibacillus aneurinilyticus D-21 对 β-氰氟氰菊酯的降解作用，并利用转录组分析确定了参与降解过程的关键基因。酯酶基因 est3617 被克隆并验证其对拟除虫菊酯水解是必需的。Est3617 酶与其活性相关的催化三联体 Ser₉₇-Asp₁₉₃-His₂₂₃ 非常相似。它在 45°C 和 pH 9 条件下表现出最大活性，并在广泛的条件下保持高稳定性...

环境影响

拟除虫菊酯的广泛污染对环境和公共健康构成威胁。在本研究中，从 Pixian 豆酱中分离出的 Aneurinibacillus aneurinilyticus 证明了其通过初始酯键水解降解 β-氰氟氰菊酯的能力。在 β-氰氟氰菊酯应激条件下的转录组分析确定了关键的水解酶 Est3617，该酶在不同的温度和 pH 下表现出稳健的稳定性和广泛的底物特异性，突显了其实用性...

CRediT 作者贡献声明

张梦梅：可视化、方法学。 黄思琪：写作 – 审稿与编辑、撰写原始草稿、验证、方法学、调查、数据分析、概念化。 唐杰：写作 – 审稿与编辑、资源获取、项目管理、概念化。 余轩：写作 – 审稿与编辑、方法学、数据分析、概念化。 彭传宁：软件、方法学、数据分析。 张青：监督、资源获取、调查。 刘园曦：

利益冲突声明

所有作者声明与任何可能不恰当地影响本工作的个人或组织没有财务和个人关系。不存在任何潜在的利益冲突，包括就业、咨询、股票所有权、酬金、有偿专家证词、专利申请/注册以及资助或其他资金。我们声明在研究过程中没有使用 AI 工具来分析和从数据中提取见解，除非是为了检查...

致谢

我们感谢国家自然科学基金（32102094, 32502366）、四川省重点研发项目（23ZDYF3100）、四川省自然科学基金（2025ZNSFSC1064, 2025ZNSFSC1060, 2025ZNSFSC0213）以及西华大学的人才引进计划（ZX20250092, Z241089）对本研究的财政支持。