双黄酮类化合物通过抑制Aβ42内化以减轻其细胞毒性作用的研究 中文标题

《Molecular Nutrition & Food Research》：Biflavonoids can Potentially Inhibit Amyloid Beta Internalization to Mitigate Its Cytotoxic Events

本综述系统阐述双黄酮类天然化合物通过双重作用机制对抗阿尔茨海默病（AD）关键病理蛋白Aβ42的毒性：一方面直接抑制Aβ42的β-折叠构象转变、寡聚体及纤维形成；另一方面有效阻断Aβ42（尤其是寡聚体形式）的细胞内存作用，从而抑制核纤层蛋白（lamin）断裂和caspase活化等下游细胞死亡事件。研究为双黄酮类化合物作为多靶点抗淀粉样蛋白药物的开发提供了实验依据。

　　

1 引言

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种主要影响老年人的神经退行性疾病，也是最常见的痴呆类型。随着全球人口老龄化，AD的患病率预计将持续上升。Aβ₄₂肽是AD病理的核心，其由淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein, APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶依次切割产生（淀粉样蛋白生成途径）。Aβ₄₂单体易于错误折叠形成富含β-片层的结构，进而聚集形成寡聚体、原纤维和成熟纤维。这些聚集体不仅在大脑实质中形成淀粉样斑块，也可在脑血管中积累导致脑淀粉样血管病（Cerebral Amyloid Angiopathy, CAA）。近年研究发现，可溶性寡聚体和原纤维比沉积的纤维具有更强的神经毒性，它们在AD的早期 synaptic dysfunction 和神经元损伤中起关键作用。

Aβ₄₂的细胞毒性与其在细胞内的定位密切相关。研究表明，细胞内积累的Aβ₄₂（特别是寡聚体形式，可通过内存作用进入神经元）比细胞外Aβ具有更强的引发细胞凋亡（如通过JNK信号通路）的能力。因此，阻止Aβ₄₂进入细胞被认为是减轻其毒性的有效策略。

黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的多酚物质，具有多种健康益处，包括抗氧化、抗菌、抗炎以及降低年龄相关性痴呆风险的作用。流行病学研究显示，较高的膳食黄酮摄入量与较低的痴呆患病风险相关。一些特定的黄酮类化合物（如槲皮素、EGCG）已被证明能够抑制Aβ₄₂的聚集并减轻其细胞毒性。

双黄酮类化合物（Biflavonoids）是由两个黄酮单体通过化学键连接而成的天然化合物，其 dimeric 结构使其在大小、形状和生物活性上不同于单体黄酮。来源于银杏（Ginkgo biloba）和卷柏属（Selaginella）植物的双黄酮类化合物显示出抗炎、抗氧化和抗淀粉样蛋白活性，并且通常比其单体形式具有更强的效力，可能作为多靶点治疗剂用于神经退行性疾病。

本研究旨在探讨双黄酮类化合物（他瓦尼亚黄酮 Taiwaniaflavone, TF 和穗花杉双黄酮 Amentoflavone, AF）是否通过影响Aβ₄₂的细胞内存作用来发挥其细胞保护作用。

2 材料与方法

研究使用的TF和AF从卷柏（Selaginella tamariscina）中分离纯化。Aβ₄₂肽以融合蛋白形式在大肠杆菌（E. coli）中表达并纯化，随后制备成单体（mAβ）、寡聚体（oAβ）和纤维（fAβ）形式。细胞实验主要使用人宫颈癌HeLa细胞系（因其 robustly 表达caspases和核纤层蛋白，这些是Aβ₄₂介导的细胞毒性通路中的关键蛋白，适合用于内存作用研究），同时使用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞评估细胞毒性。

细胞活力通过MTT法和alamarBlue法检测。使用共聚焦显微镜和Western blotting观察和分析Aβ₄₂的细胞内存情况。通过Western blotting检测核纤层蛋白B（lamin B）的断裂，并通过荧光底物法测定caspase-3（DEVDase）活性。在无细胞条件下，利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察Aβ₄₂聚集体形态，硫黄素T（Thioflavin T, ThT）荧光法评估纤维形成，圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）分析Aβ₄₂的二级结构变化。

3 结果

3.1 针对Aβ₄₂诱导毒性的细胞保护作用

细胞活力实验表明，不同形式的Aβ₄₂毒性强弱为：寡聚体（oAβ） > 单体（mAβ） > 纤维（fAβ）。fAβ毒性最低，因此在后续研究中被排除。TF和AF能剂量依赖性地保护HeLa细胞免受mAβ和oAβ（20 μM）诱导的细胞毒性，其中TF的保护作用略强于AF。

3.2 抑制Aβ₄₂内化从而抑制细胞毒性事件

共聚焦显微镜和Western blotting结果明确显示，oAβ能有效进入细胞，而TF和AF（10 μM）能显著阻断oAβ（20 μM）的内存作用。同时，双黄酮类化合物处理也抑制了由Aβ₄₂内化所触发的下游事件：核纤层蛋白B的断裂和caspase-3的活化。重要的是，如果在Aβ₄₂处理细胞24小时后再加入双黄酮类化合物，则无法逆转其细胞毒性，表明双黄酮的保护作用依赖于在Aβ₄₂进入细胞前发挥作用。

3.3 改变Aβ₄₂肽的生物物理特性以预防其毒性

在无细胞体系中，TEM观察显示TF和AF能抑制Aβ₄₂寡聚体和纤维的形成。CD光谱分析表明，双黄酮类化合物能减少Aβ₄₂在37°C孵育24小时后形成的β-片层结构。ThT荧光实验进一步证实，TF和AF能显著抑制Aβ₄₂的纤维形成过程。这些结果表明，双黄酮类化合物通过干扰Aβ₄₂的关键结构转变（β-片层形成、寡聚化和纤维化），阻止了具有细胞穿透能力和毒性潜能的Aβ₄₂物种的形成。

4 讨论

本研究揭示了双黄酮类化合物（TF和AF）保护细胞免受Aβ₄₂毒性的新颖机制。除了已知的抗淀粉样蛋白生成特性（抑制Aβ₄₂聚集）外，本研究首次证实双黄酮类化合物能有效阻断Aβ₄₂（特别是高毒性的寡聚体）进入细胞。这种对内存作用的抑制，阻止了细胞内Aβ₄₂积累所触发的关键细胞死亡事件，如caspase激活和核纤层蛋白断裂。研究强调了阻止Aβ₄₂细胞内化作为神经保护策略的重要性，并将双黄酮类化合物定位为通过双重机制（抑制构象转变和阻止细胞摄取）发挥作用的潜在抗淀粉样蛋白药物。

5 结论

综上所述，双黄酮类化合物通过抑制Aβ₄₂的细胞内存作用及其关键的构象转变（β-片层、寡聚体、纤维形成），有效减轻了Aβ₄₂诱导的细胞毒性。这些发现突显了双黄酮类化合物作为治疗阿尔茨海默病等以Aβ₄₂聚集为特征的神经退行性疾病的多靶点治疗剂的潜力。