离体急性脑片制备过程中氧化损伤导致抑制性GABA能神经元丢失对癫痫样活动发生与动态的影响

《Journal of Neurochemistry》：Inhibitory GABAergic Neuron Loss due to Oxidative Damage During Ex Vivo Acute Brain Slice Preparation Influences Genesis and Dynamics of Epileptiform Activity

本刊推荐：本研究系统评估了不同脑片制备方法（经心脏灌注/断头、蔗糖/正常人工脑脊液）对神经元存活及网络功能的影响，发现经心脏灌注联合蔗糖ACSF（sACSF）最佳保存抑制性中间神经元（尤以PV+亚型为著）；其丢失主因氧化损伤，并通过抗氧化剂或HIF-1α抑制剂验证。此发现对癫痫模型（0 Mg2+/4-AP诱导）的诱导成功率与发作动态有决定性影响，提示脑片制备方法的选择直接关系实验结果的生理相关性。

　　

引言

自1957年离体急性脑片电生理技术问世以来，其已成为神经科学研究的重要工具。然而，不同实验室在脑片制备方法上存在显著差异，包括动物处死方式（断头或经心脏灌注）和切割液成分（正常人工脑脊液nACSF或蔗糖人工脑脊液sACSF）。这些差异可能影响脑片的神经元保存状态及网络功能，尤其在癫痫研究领域，不同制备方法对抑制性中间神经元存活的影响尚未系统评估。本研究旨在填补这一空白，重点探讨切割液成分和处死方式对抑制性GABA能神经元保存及癫痫样活动诱导的动态影响。

方法

研究使用10-12周龄雄性Wistar大鼠，通过四种脑片制备组合（DS：断头+sACSF；DN：断头+nACSF；PS：经心脏灌注+sACSF；PN：经心脏灌注+nACSF）制备海马旁皮质脑片。通过免疫组化（标记NeuN、GABA、CaMKII及各类中间神经元亚型标志物如PV、CB、VIP等）量化神经元密度，并通过体外电生理记录在零镁（0 Mg²⁺）和4-氨基吡啶（4-AP）癫痫模型中评估癫痫样活动（SLEs）的诱导概率与动态。此外，通过补充抗氧化剂（抗坏血酸、α-生育酚、N-乙酰半胱氨酸）或HIF-1α抑制剂（白杨素）的切割液进行干预，并检测蛋白羰基浓度以评估氧化损伤程度。

结果

神经元存活率随脑片制备方法变化

PS组脑片的NeuN阳性神经元密度最高（1115.0±46.5 cells/mm²），显著高于DN组（738.5±58.1 cells/mm²）和DS组（850.1±99.9 cells/mm²）。GABA能神经元在PS组中保存最佳（423.5±48.4 cells/mm²），而兴奋性神经元（CaMKII阳性）同样在PS组最丰富（285.6±42.7 cells/mm²）。结果表明，经心脏灌注联合sACSF可最大程度保留抑制性与兴奋性神经元。

特定抑制性中间神经元亚型选择性丢失

不同制备方法对中间神经元亚型的影响具选择性：PV阳性中间神经元在DN组丢失最显著（3.7±1.0 cells/mm²），而PS组其密度最高（67.6±7.0 cells/mm²）。CB阳性中间神经元在PS组密度最高（164.0±20.3 cells/mm²），而DS组VIP阳性和CCK阳性中间神经元保存较好。SOM与CR阳性神经元密度在各组间无显著差异。

中间神经元保存影响网络兴奋性与功能

在0 Mg²⁺模型中，DN组脑片的SLE诱导概率最高，且SLE出现时间更早（9.5±2.3分钟）、持续时间更短（12.2±1.9秒）。在4-AP模型中，DN组SLE诱导概率达100%，且SLE持续时间显著短于sACSF制备的脑片。结果表明，抑制性神经元丢失导致网络超兴奋性，并改变癫痫样活动的动态特征。

限制氧化损伤可保存抑制性中间神经元

在DN切割液中添加抗氧化剂（DA组）后，PV阳性中间神经元密度从3.7±1.0 cells/mm²升至18.7±4.5 cells/mm²，SLE诱导概率从58.6%降至28.6%，且SLE持续时间延长至21.8±1.4秒。蛋白羰基浓度有下降趋势，但未达统计学显著性。

氧化损伤由缺氧应激反应介导

添加HIF-1α抑制剂白杨素（DC组）后，蛋白羰基浓度显著降低（10.4±2.5 nmol/mg蛋白），PV阳性中间神经元密度部分恢复（5.9±1.2 cells/mm²），SLE诱导概率降至15%。但SLE动态参数无显著改变，提示HIF-1α可能通过多通路参与损伤过程。

讨论

本研究首次系统揭示脑片制备方法通过氧化损伤机制选择性影响抑制性中间神经元（尤其是PV阳性亚型）存活，进而显著改变癫痫样活动的诱导与动态。经心脏灌注联合sACSF可最大程度保留抑制性环路，更接近生理状态；而断头联合nACSF制备的脑片因抑制丢失易诱导“超兴奋”癫痫活动。抗氧化干预或抑制HIF-1α通路可部分挽救神经元丢失，证实氧化损伤为核心机制。这一发现对癫痫模型构建、药物筛选及网络生理学研究具有重要方法学意义，未来需考虑制备方法对结果解释的潜在影响。

结论

脑片制备方法的选择直接影响抑制性GABA能神经元的保存状态及网络抑制水平。经心脏灌注联合sACSF为最优方案，可有效减少氧化损伤所致的神经元丢失。在癫痫等研究中，脑片制备的标准化将提升实验结果的生理相关性与可重复性。