《Molecular Plant Pathology》：Cdc25-Mediated Activation of the Small GTPase RasB Is Essential for Hyphal Fusion and Symbiotic Infection of Epichlo? festucae
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本研究发现香柱菌（Epichlo? festucae）的Cdc25（细胞分裂周期蛋白25）通过激活小GTP酶RasB，调控菌丝融合和共生感染过程。该Cdc25-RasB信号模块位于MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）级联上游，其功能缺失导致菌丝融合能力丧失和宿主植物感染失败。研究揭示了真菌如何进化重塑保守的Cdc25-Ras信号模块，从致病性转向互利共生，为理解真菌-植物互作机制提供了新视角。
引言：真菌共生与菌丝融合的密切联系
香柱菌（Epichlo? festucae）作为一种丝状内生真菌，能与多年生黑麦草建立无症状的互利共生关系。这种平衡共生关系的维持需要真菌与宿主生长的精细协调。研究发现，许多共生缺陷突变体在培养条件下也缺乏菌丝融合能力，表明菌丝融合所需的信号转导与共生建立存在功能联系。
菌丝融合缺陷突变体的筛选与鉴定
研究团队通过限制性内切酶介导的整合（REMI）插入诱变技术，从约1200个转化子中筛选出三个菌丝融合缺陷突变体（RPA41、RPA112和RPA519）。这些突变体在3%琼脂培养基上基本不发生菌丝融合，但菌落生长和分生孢子形成与野生型无显著差异。宿主接种实验显示，RPA112和RPA519引起宿主生长抑制，而RPA41则完全丧失感染能力。
Cdc25基因的鉴定与功能验证
分子分析表明，RPA41的插入位点位于cdc25基因（C2857_001629）内，该基因编码Ras特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）。EfCdc25蛋白包含典型的SH3结构域、Ras交换基序（REM）结构域和Ras结合域。敲除cdc25或特异性缺失其Ras结合域（Δcdc25-RasBD）均导致菌丝融合能力完全丧失，且突变体无法建立共生感染。回补实验证实这些表型确实由cdc25缺失引起。
Cdc25与RasB的特异性相互作用
酵母双杂交实验显示，Cdc25特异性与五种Ras蛋白中的RasB相互作用。AlphaFold3结构预测表明，Cdc25的RasGEF催化结构域与RasB的Switch区域形成稳定界面（ipTM=0.77）。亚细胞定位研究发现，GFP-RasB在菌丝隔膜处稳定存在，而在融合过程中短暂聚集于菌丝顶端。多次尝试敲除rasB均未成功，提示该基因可能为必需基因。
组成型活性RasB回补cdc25缺失表型
在Δcdc25菌株中表达组成型活性RasB（CA-RasB，G16V突变）可恢复菌丝融合能力和宿主感染能力，表明Cdc25通过激活RasB发挥作用。然而，CA-RasB无法回补ΔmpkB和ΔnoxA突变体的菌丝融合缺陷，提示Cdc25-RasB模块位于MpkB上游，而NoxA可能位于其下游或平行通路中。
cAMP信号参与菌丝融合调控
外源添加cAMP（10 mM）可部分恢复Δcdc25菌株的菌丝融合，表明Cdc25-RasB模块至少部分通过cAMP依赖性信号通路发挥作用。Cdc25的SH3结构域可能介导与腺苷酸环化酶的相互作用，这与真菌中Ras-cAMP/PKA通路的保守性一致。
讨论：信号通路的进化重编程与协同调控
研究表明，香柱菌进化性地重编程了保守的Cdc25-Ras信号模块，从调控致病性转向维持互利共生。在病原真菌中，该模块通常调控侵染相关形态发生；而在香柱菌中，它协调菌丝融合和宿主同步生长。Cdc25-RasB、MAPK、NADPH氧化酶和cAMP等多条信号通路形成复杂网络，通过支架蛋白（如SO）和转录因子（如ProA、NsiA）整合，共同维持共生稳态。
实验方法概述
研究采用REMI诱变筛选菌丝融合缺陷突变体，通过Southern blot、酵母双杂交、荧光显微技术等方法进行基因鉴定和功能验证。真菌转化、植物接种和显微观察均采用成熟实验方案，确保结果可靠性。
这项研究深入揭示了丝状内生真菌通过Cdc25-RasB信号模块协调菌丝融合和共生建立的分子机制，为理解真菌-植物互作的进化适应提供了重要见解。
