《Neuropathology and Applied Neurobiology》：Enhancing the Performance of a Blood-Based Diagnostic Screening Tool for Dysferlinopathy: Optimising an Immunoassay Across Continents
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本文验证了一种基于外周血涂片（PBF）的中性粒细胞免疫组化（IHC）检测方法，用于筛查dysferlinopathy（一种由DYSF基因突变引起的罕见肌营养不良症）。研究显示该方法灵敏度高达100%，但特异性受样本质量和存储温度影响显著。在高温（>30°C）环境下长期存储会导致蛋白降解，而4°C冷藏可保持dysferlin免疫反应性长达20周。该检测法具有快速、低成本、微创等优势，适用于资源有限地区，但需规范采血技术和存储流程以确保可靠性。
摘要
dysferlin是一种237-kDa的蛋白，对肌肉功能至关重要，其缺失会导致dysferlinopathy——一种由DYSF基因隐性突变引起的罕见肌营养不良症。虽然基因分析是主要诊断手段，但蛋白水平检测对确认致病性（尤其针对意义未明变异）仍不可或缺。本研究旨在验证一种基于外周血涂片（PBF）中性粒细胞的免疫组化检测法，并评估不同存储条件对其性能的影响，重点优化可能影响 assay 可靠性和重复性的变量。
引言
dysferlinopathy的诊断依赖临床评估、基因测序和蛋白表达分析。当前蛋白检测多通过肌肉活检进行免疫组化（IHC）或Western blot（WB），但活检具侵入性、成本高且耗时长。血液中CD14+单核细胞表达dysferlin，但相关检测步骤繁琐。中性粒细胞因易获取且表达dysferlin，成为更理想的检测对象。本研究基于前期建立的PBF-IHC方法，进一步在印度队列中验证其可行性，并重点分析样本收集和存储条件对 assay 的影响。
材料与方法
研究纳入22例经基因确诊的dysferlinopathy患者和20名健康对照。通过指血或静脉血制备PBF，部分样本在采集后3周内寄至英国纽卡斯尔进行染色，备份片在印度孟买的治疗药物监测实验室存储7–18周后寄送。评估不同存储温度（室温、4°C、37°C）对dysferlin免疫反应性的影响。IHC染色使用抗dysferlin抗体（NCL-Hamlet），结果由两名研究人员盲法评分。同时，以CD14+单核细胞WB作为对照验证IHC结果。
结果
3.1 Dysferlin在患者中表达缺失或显著降低
所有患者样本均显示dysferlin表达缺失或显著降低，灵敏度达100%。但15%的对照样本因涂片质量差（如细胞聚集、形态异常）出现标记减弱，导致特异性仅为45%。涂片质量不佳可能导致中性粒细胞激活和蛋白降解，影响结果判读。
3.2 存储条件显著影响蛋白保存
此前研究显示PBF在室温（20°C–22°C）可稳定存储2年，但本研究中在印度高温（>30°C）环境下存储18周的样本出现dysferlin信号丢失，而同期在英国室温存储的样本信号保持良好。表明高温会加速蛋白降解，校正存储条件后特异性提升至75%。
3.3 低温存储保持dysferlin稳定性
PBF在4°C存储20周后dysferlin标记仍保持完整。短期暴露于37°C长达1.5周未引起降解，提示样本在运输中可耐受短暂高温，但长期存储需严格控制温度。
3.4 PBF-IHC与WB结果一致
10例样本同时进行PBF-IHC和CD14+单核细胞WB检测，两种方法结果高度一致，验证了IHC阴性结果的可靠性。
讨论
PBF-based dysferlin检测法具有微创、快速、成本低等优势，适用于资源有限地区的一线筛查。但其性能高度依赖涂片质量和存储条件：不规范涂片制备可能导致中性粒细胞脱颗粒和蛋白降解；高温环境长期存储会显著降低信号强度。建议操作人员接受规范培训，确保涂片均匀快速制备，且样本在4°C存储直至检测。该 assay 可作为DYSF基因意义未明变异致病性评估的辅助工具，未来需在更大队列中验证并制定标准化流程，以推动其在临床的广泛应用。
