《Poultry Science》：The host RNA helicase DDX6 restricts avian influenza virus replication by targeting viral NP and modulating ISG15
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本研究揭示了宿主RNA解旋酶DDX6作为禽流感病毒核蛋白(NP)的新型相互作用因子，通过双重机制抑制H7N9亚型AIV复制：一方面直接阻碍NP蛋白核转运并抑制病毒聚合酶活性；另一方面通过激活I型干扰素(IFN-α/β)信号通路并精细调控ISG15功能状态（上调游离单体同时通过USP16/USP18下调ISG化修饰），为宿主抗病毒防御机制提供了新的理论依据。
禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）特别是H7N9亚型，自2013年在长三角地区首次发现以来，持续对公共卫生安全构成严重威胁。这种病毒不仅能够感染禽类，还表现出跨物种传播至哺乳动物和人类的能力，其高致病性和大流行潜力引发广泛关注。病毒复制过程中的关键蛋白——核蛋白（Nucleoprotein, NP），作为病毒核糖核蛋白复合体（vRNP）的核心组分，在病毒生命周期中扮演着不可或缺的角色。然而，NP与宿主蛋白之间的相互作用网络及其功能后果，尤其是其如何被宿主的抗病毒机制调控，仍有大量未知亟待揭示。
针对这一科学问题，扬州大学刘秀梵院士团队在《Poultry Science》上发表了一项重要研究。该研究聚焦于宿主因子如何通过调控NP蛋白的功能来限制AIV复制。研究人员首先利用蛋白质组学技术，在ISG15过表达和敲除的细胞模型中，筛选与NP相互作用的宿主蛋白。结果发现，DEAD-box解旋酶家族成员DDX6是一个与NP相互作用且其相互作用受ISG15显著调控的关键宿主因子。
为了开展研究，研究人员运用了多种关键技术方法。研究使用了H7N9 AIV毒株（A/Chicken/Eastern China/JTC11/2013）感染人肺腺癌细胞（A549）及其ISG15基因修饰细胞系（A549-ISG15和A549-ISG15KO）。通过免疫共沉淀联合质谱分析筛选NP互作蛋白；利用共免疫沉淀、免疫荧光共定位、双分子荧光互补和分子对接实验验证蛋白相互作用；通过核质分离和病毒聚合酶活性报告系统分析DDX6对NP核转运和病毒复制的影响；采用实时荧光定量PCR和Western blot检测干扰素通路相关基因和蛋白表达。
鉴定和分析与NP相互作用的宿主蛋白
通过质谱分析，研究人员在A549、A549-ISG15和A549-ISG15KO细胞中鉴定出860个与NP潜在相互作用的宿主蛋白。维恩图分析显示，ISG15过表达和敲除条件下存在独特的相互作用蛋白谱。特别值得注意的是，DDX家族蛋白，尤其是DDX6，与NP的相互作用强度受ISG15状态的显著影响。在ISG15敲除细胞中，DDX6与NP的相互作用比例高达25.5%，而在ISG15过表达细胞中降至13.7%，表明ISG15负调控DDX6与NP的结合。
验证DDX6与NP蛋白之间的相互作用
研究人员通过三种独立的实验方法证实了DDX6与NP之间的直接相互作用。免疫共沉淀实验显示，在用NP抗体沉淀的复合物中可检测到DDX6蛋白。免疫荧光分析表明DDX6与NP在细胞内存在明显的共定位。双分子荧光互补实验进一步提供了直观证据：当DDX6与NP-VC155融合蛋白共表达时，可观察到强烈的荧光信号，证实了两者之间的直接相互作用。
NP保守性和DDX6-NP相互作用的生物信息学分析
对H5N1、H7N9和H9N2等不同AIV基因型NP序列的同源性分析显示，NP基因在AIV不同亚型间具有高度保守性（序列相似性85%-100%）。利用AlphaFold3预测的DDX6-NP复合物三维结构显示，两者之间存在稳定的结合界面，涉及7个氢键网络。结合自由能计算结果表明DDX6与NP之间存在强烈的自发相互作用（ΔG = -12.7 kcal/mol）。
DDX6损害NP核转运过程
鉴于NP的核定位对AIV复制至关重要，研究人员探讨了DDX6对NP核转运的影响。核质分离实验显示，在AIV感染后4-8小时，NP成功转运至细胞核。然而，DDX6过表达导致核内NP水平显著降低（约50%），而胞质NP水平相应增加，表明DDX6抑制了NP的核输入过程。
DDX6抑制病毒聚合酶活性和复制能力
病毒聚合酶活性检测表明，DDX6过表达显著抑制了以荧光素酶报告系统评估的病毒聚合酶功能。病毒滴度测定进一步证实，在DDX6过表达的A549细胞中，AIV的复制能力明显受损，在感染后36、48和60小时的病毒滴度显著低于对照组。相反，DDX6敲低则增强了病毒复制。绝对定量PCR分析显示DDX6过表达降低病毒NP mRNA水平，而敲低则增加其水平，进一步支持DDX6对病毒复制的抑制作用。
ISG15是DDX6调控AIV复制过程的关键靶点
动态表达分析显示，DDX6持续上调ISG15 mRNA水平，在转染24小时后诱导近300倍的增加。值得注意的是，DDX6过表达不仅增加ISG15单体蛋白水平，同时降低ISG化修饰水平。机制上，DDX6通过上调去泛素化酶USP16和USP18的表达来调控ISG化过程，这为解释DDX6如何精细调控ISG15的功能状态提供了线索。
I型干扰素是DDX6诱导的ISG15调控的关键上游介质
研究表明，DDX6过表达显著增强IFN-α和IFN-β的mRNA水平，但不影响RIG-I、MAVS、IRF3和IRF7等上游信号分子的转录水平，提示DDX6可能通过转录后机制调控I型干扰素产生，进而激活ISG15等下游抗病毒效应分子。
该研究的结论部分强调，DDX6作为宿主因子通过双重机制抑制H7N9 AIV复制：一方面通过直接与NP相互作用，阻碍其核转运并抑制病毒聚合酶活性；另一方面通过激活I型干扰素信号通路，并精细调控ISG15的功能状态（增加抗病毒单体形式，同时通过USP16/USP18减少ISG化修饰）。这些发现不仅确立了DDX6作为重要的宿主抗病毒因子，也丰富了我们对宿主-病毒相互作用网络的理解，为开发新的禽流感防控策略提供了理论依据。
讨论部分进一步阐述了研究结果的意义。H7N9 AIV自出现以来持续进化，对人类健康构成潜在威胁。NP作为病毒复制早期的关键蛋白，其与宿主因子的相互作用网络尚未完全阐明。本研究首次发现DDX6与NP直接相互作用，并受ISG15调控。与已知的某些DDX家族成员（如DDX5）不同，DDX6在AIV感染中表现出明确的抗病毒功能。分子对接分析为这一相互作用提供了结构基础，尽管具体的结合位点仍需实验验证。DDX6对NP核转运的抑制作用与MOV10等已知宿主因子类似，但通过独特的机制实现。值得注意的是，DDX6还可能影响PB1蛋白表达，提示其可能通过多种途径破坏病毒复制复合体的完整性。ISG15调控机制的阐明是另一重要发现，DDX6通过上调USP16/USP19来减少ISG化，同时增加游离ISG15单体，这种双重调控可能优化宿主的抗病毒反应。虽然DDX6增强IFN-I产生但不影响上游信号分子转录，提示其可能通过转录后机制发挥作用，这与某些RNA解旋酶调控mRNA稳定性的功能一致。总体而言，这项研究揭示了DDX6在抗AIV免疫中的关键作用，为理解宿主-病毒相互作用提供了新视角。
