《Virologica Sinica》：Pseudorabies virus TK protein antagonizes alpha interferon response by interfering with the JAK1-STAT1 interaction
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本研究聚焦伪狂犬病毒（PRV）如何逃逸宿主I型干扰素（IFN-I）抗病毒反应这一关键科学问题。研究人员发现，PRV的胸苷激酶（TK）蛋白能够直接结合宿主JAK1和STAT1信号分子，破坏其相互作用，从而抑制STAT1磷酸化和下游干扰素刺激基因（ISG）的表达。该研究不仅揭示了TK蛋白在病毒免疫逃逸中的新功能，拓展了对PRV致病机制的理解，也为开发新型抗病毒策略提供了潜在靶点。
在病毒与宿主的漫长军备竞赛中，逃逸宿主的先天免疫反应，特别是I型干扰素（Type I Interferon, IFN-I）介导的抗病毒防御，是病毒成功建立感染的关键。伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV），作为α疱疹病毒亚科的成员，是奥耶斯基氏病的病原体，给全球养猪业造成重大经济损失，并存在潜在的人畜共患风险。与其它疱疹病毒类似，PRV能够在宿主体内建立终身潜伏感染，这与其精湛的免疫逃逸能力密不可分。尽管已知PRV能够弱化IFN-I反应，并且已有数个病毒蛋白（如UL50、UL42、EP0等）被鉴定为IFN信号通路的拮抗剂，但PRV逃逸IFN-I反应的分子“武器库”仍未完全阐明。
胸苷激酶（Thymidine kinase, TK）是PRV编码的一个关键毒力因子，其基因（UL23）对病毒在神经组织中的复制和神经嗜性至关重要，但在非神经细胞中并非病毒复制所必需。传统上，TK的功能被认为主要集中于核苷酸代谢，为病毒DNA合成提供原料。基于此，TK基因缺失（ΔTK）的PRV毒株毒力显著减弱，已成为构建减毒活疫苗的常用策略。然而，TK是否在病毒与宿主免疫系统的相互作用中扮演角色，此前一直是个未知数。
有趣的是，研究人员在早期的筛选中并未发现TK具有明显的IFN拮抗活性，但在后续针对不同细胞系（HeLa细胞）的深入筛选中，却意外观察到TK能够显著抑制IFNα诱导的干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes, ISGs）的表达。这一矛盾提示，TK的免疫调节功能可能具有细胞类型特异性或依赖于更精细的检测方法。这一意外发现激发了研究人员的浓厚兴趣，促使他们系统性地探究TK是否以及如何调控宿主的IFN-I信号通路。
为了回答这些问题，中国农业大学的研究团队在《Virologica Sinica》上发表了他们的研究成果。他们综合运用了分子生物学、细胞生物学和生物化学等多种技术方法。研究的关键技术包括：在HeLa细胞和原代猪肺泡巨噬细胞（Primary porcine alveolar macrophages, PAMs）中进行基因过表达和功能缺失（使用TK缺陷病毒PRV-ΔTK）实验以评估TK对IFN信号的影响；通过蛋白质印迹（Western blot）和定量实时PCR（qRT-PCR）分析信号分子表达和磷酸化水平；利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）和GST pull-down实验验证蛋白质间的直接相互作用；通过细胞核质分离技术研究STATs的核转位；构建TK截短体以确定其关键功能结构域；并运用AlphaFold2和ColabFold进行蛋白质结构预测和分子对接分析。
TK抑制IFNα诱导的ISGs转录和表达
研究人员首先在HeLa细胞中过表达一系列PRV蛋白，发现TK能够像已知的IFN拮抗剂（如UL13、UL50）一样，显著抑制IFNα诱导的ISG15蛋白的表达。为了验证这一发现在猪源细胞中的相关性，他们在原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中进行了实验，结果一致：过表达TK能显著降低IFNα诱导的ISG15和ISG54的mRNA和蛋白水平。相反，感染TK缺陷型PRV（PRV-ΔTK）的猪肾PK15细胞，在IFNα处理后，表现出比野生型PRV（PRV-WT）感染细胞更高的ISG表达水平，同时病毒蛋白表达和病毒滴度显著降低。这些结果明确表明，TK确实能够抑制IFN-I信号通路，并且其缺失使得病毒对IFN-I的抗病毒作用更加敏感。
TK抑制STAT1/2磷酸化但不影响其核转位
机制上，研究人员发现TK的过表达并不影响JAK-STAT信号通路关键元件（JAK1、TYK2、STAT1、STAT2）的总蛋白水平。然而，TK显著降低了IFNα诱导的STAT1和STAT2的磷酸化水平。通过核质分离实验进一步证明，TK虽然减少了磷酸化STAT1（P-STAT1）和磷酸化STAT2（P-STAT2）的总量，但并未改变它们在不同细胞区室间的相对分布比例，说明TK的抑制作用发生在STATs磷酸化激活环节，而非其核转位过程。在病毒感染背景下，PRV-ΔTK感染的细胞中STAT1和STAT2的磷酸化水平也持续高于PRV-WT感染的细胞，进一步证实了TK在病毒感染过程中抑制STAT激活的功能。
TK与STAT1相互作用但不影响ISGF3复合体组装
那么TK是如何抑制STAT磷酸化的呢？通过免疫共沉淀实验，研究人员发现TK能够与STAT1和STAT2发生相互作用，并且在PRV感染的细胞中，内源性的TK也能与内源性的STAT1和STAT2结合。GST pull-down实验证实TK与STAT1之间存在直接相互作用。然而，TK的存在并不影响STAT1、STAT2和IRF9形成关键的转录复合体ISGF3，表明TK并非通过破坏ISGF3的组装来发挥作用。
TK干扰JAK1-STAT1相互作用
研究的突破口出现在对上游信号的探究。JAK1是激活STAT1的关键激酶。研究人员发现，TK不仅能结合STAT1，也能与JAK1相互作用。更重要的是，当TK存在时，JAK1和STAT1之间的结合显著减弱。这种干扰作用在存在内源性JAK1的工程化细胞系（HeLa-Flag-JAK1）中得到了证实，并且在PRV自然感染的情况下，病毒TK的表达同样减少了内源性JAK1与STAT1的结合。这表明，TK通过同时“抓住”JAK1和STAT1，物理性地阻碍了它们的正常相互作用，从而切断了JAK1对STAT1的磷酸化激活信号。
TK的第107–212位氨基酸对其抑制功能至关重要
为了精确定位TK负责免疫抑制的关键区域，研究人员构建了一系列TK截短突变体。研究发现，包含第107至212位氨基酸的片段（TK-F2）对于TK与STAT1的结合以及其抑制IFN信号的功能是必需且充分的。结构预测分析显示，TK的这一区域能够结合到STAT1的某个特定区域，而该区域恰好与JAK1结合STAT1的位点存在重叠，从结构上支持了TK竞争性抑制JAK1-STAT1相互作用的模型。功能实验表明，只有包含此区域的TK全长和TK-F2截短体能够有效破坏JAK1-STAT1相互作用，并抑制STAT1磷酸化和ISG15表达。
研究结论与意义
综上所述，本研究揭示了一种全新的PRV免疫逃逸机制：其胸苷激酶（TK）蛋白，除了已知的核苷酸代谢功能外，还是一个关键的IFN-I信号通路拮抗剂。TK通过其第107–212位氨基酸区域直接结合STAT1和JAK1，干扰二者的正常相互作用，从而抑制IFNα诱导的STAT1磷酸化，最终阻断下游ISGs的表达和抗病毒状态的建立。
这项研究的意义重大。首先，它极大地拓展了我们对PRV致病机制的理解，揭示了TK蛋白的双重功能（代谢与免疫逃逸），这为解释TK缺陷病毒毒力显著减弱的现象提供了新的视角——其减毒不仅源于核苷酸代谢缺陷，还可能归因于免疫逃逸能力的削弱。其次，研究发现了PRV靶向JAK-STAT通路的一个新策略，即通过竞争性结合干扰JAK1与STAT1的相互作用，这不同于其他病毒常见的降解信号蛋白或抑制激酶活性的机制。此外，TK的免疫抑制功能与其酶活功能在结构上的可分离性（关键区域独立于催化位点E33），为未来开发特异性靶向TK免疫抑制功能而不影响其代谢功能的抗病毒药物提供了理论依据和潜在的靶点。最后，该研究结果也对PRV疫苗设计具有启示意义，TK缺失的减毒疫苗株其安全性可能部分得益于其增强了对宿主IFN反应的敏感性。
总之，这项工作不仅鉴定了一个新的病毒免疫调节蛋白，阐明了其精细的分子机制，而且为深入理解病毒-宿主相互作用以及开发新的抗病毒策略提供了重要的科学基础。
