《Cell》：CRISPR screens in iPSC-derived neurons reveal principles of tau proteostasis
编辑推荐：
本研究针对tau蛋白病中tau寡聚体积累的分子调控机制尚不明确的难题，利用CRISPRi技术在携带FTD致病突变MAPT V337M的人iPSC来源神经元中进行了全基因组筛选。研究发现CUL5-SOCS4 E3泛素连接酶复合物可直接泛素化tau蛋白，其表达与阿尔茨海默病及原发性tau蛋白病患者神经元的存活性正相关；同时发现线粒体功能障碍可通过蛋白酶体产生具有疾病相关性的N端tau片段（NTA-tau），并改变tau纤维聚集动力学。该研究系统揭示了人神经元中tau蛋白稳态的核心调控网络，为tau蛋白病提供了新的潜在治疗靶点。
在老龄化社会中，神经退行性疾病日益成为沉重的健康负担。其中，以tau蛋白异常聚集为特征的tau蛋白病（Tauopathy），包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）和额颞叶痴呆（Frontotemporal Dementia, FTD），是两类最常见的疾病。在这些疾病中，特定的神经元亚型会选择性出现tau蛋白聚集、功能障碍乃至死亡，然而导致这种选择性易感性的分子机制至今成谜。更棘手的是，绝大多数tau蛋白病病例是散发性的，这意味着除了少数由MAPT基因突变引起的家族性疾病外，细胞内环境因素在调控没有基因突变的病理性tau蛋白积累过程中扮演了关键角色，但具体有哪些细胞因子参与其中，科学家们知之甚少。
为了在人类神经元中系统性地寻找那些控制tau蛋白聚集的细胞因子，研究人员进行了一项精巧的研究。他们利用诱导多能干细胞（iPSC）技术，获得了携带家族性tau蛋白病致病突变MAPT V337M的人类神经元。值得注意的是，尽管V337M突变导致的是FTD，但其形成的tau纤维结构与AD患者脑内的tau纤维结构相同，提示针对此突变体的研究结果可能对AD也具有重要参考价值。研究团队在这些神经元中运用了CRISPR干扰（CRISPRi）技术进行全基因组筛选，这是一种能够高效、特异性地降低基因表达的技术。他们以tau寡聚体（通常被认为是tau聚集的早期形式，且毒性可能比成熟的纤维更大）的水平作为读数，成功筛选出了超过一千个能够显著影响tau寡聚体水平的基因。
深入分析筛选结果，研究人员将目光聚焦于一个名为CRL5SOCS4的E3泛素连接酶复合物上。CUL5作为该复合物的支架蛋白，与接头蛋白SOCS4等共同工作，负责为特定底物贴上“泛素”标签，标记其需要被蛋白酶体降解。研究发现，在神经元中降低CUL5或SOCS4的表达，会导致tau蛋白及其寡聚体水平升高；反之，过表达SOCS4则能降低tau水平。进一步的生物化学实验证实，CUL5确实与tau蛋白存在物理相互作用，并且CRL5SOCS4复合物能够在试管中直接催化tau蛋白发生泛素化修饰。尤为重要的是，对阿尔茨海默病患者脑组织单细胞测序数据的分析显示，CUL5及其相互作用蛋白（如ARIH2、SOCS4）的表达水平，与神经元在疾病中的韧性（即抵抗死亡的能力）呈正相关。这表明，CRL5SOCS4通路的功能正常，可能有助于保护神经元免受tau蛋白病变的损害。
研究的另一项重要发现，将线粒体功能、氧化应激与tau蛋白代谢异常联系起来。筛选结果中，氧化磷酸化通路基因的敲除对tau寡聚体水平影响最为显著。当研究人员用线粒体电子传递链抑制剂（如鱼藤酮Rotenone）处理神经元，诱导线粒体功能障碍和活性氧（ROS）水平升高时，他们观察到一个分子量约为25 kDa的tau片段特异性增加。质谱分析将该片段的产生区域定位在tau蛋白的第80至130位氨基酸附近。值得注意的是，这个片段与近年来在AD患者脑脊液和血液中被发现的、具有疾病标志物潜力的N端tau片段（NTA-tau）高度相似。机制研究表明，ROS的增加不仅直接氧化tau蛋白（特别是其中的甲硫氨酸残基），还会影响蛋白酶体的活性，从而促进了这个25 kDa片段的产生。更令人惊讶的是，在体外实验中，这个tau片段本身能够改变全长tau蛋白的聚集过程和纤维形态。
该研究综合运用了多种关键技术方法。核心是基于CRISPRi/iPSC-神经元平台的全基因组功能缺失筛选，从而在生理相关的人类细胞模型中无偏倚地发现调控因子。研究还采用了流式细胞术进行高通量表型分析，蛋白质印迹（Western Blot）、免疫共沉淀、体外泛素化实验等生物化学方法进行机制验证，并利用患者脑组织单细胞测序数据（SEA-AD数据集）进行临床相关性分析。
CRL5SOCS4调控tau蛋白稳态
研究人员通过CRISPRi筛选结合验证实验，证实敲低CUL5或其复合物成员RNF7、SOCS4会导致神经元内tau寡聚体和总tau水平升高。细胞分步分离实验表明CUL5主要存在于神经元胞体，其调控作用也主要在胞体区域发挥。利用双荧光报告系统，研究将CRL5SOCS4对tau的降解作用定位于tau蛋白的第80-130氨基酸区域，并证明该过程依赖于蛋白酶体活性。
CRL5SOCS4直接泛素化tau蛋白
免疫共沉淀实验证明CUL5与内源性tau蛋白存在相互作用。在HEK293细胞和体外重构实验中，SOCS4的过表达能促进tau蛋白的泛素化，该过程依赖于CUL5的nedd化修饰。质谱分析进一步鉴定了tau蛋白上被CRL5SOCS4复合物泛素化的具体位点，多位点位于80-130区域。
线粒体功能障碍通过氧化应激诱导病理性tau片段产生
抑制线粒体电子传递链复合物I或III（而非解偶联剂），可诱导产生25 kDa的tau片段，该过程可由抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）部分抑制。该片段可被分泌到细胞外培养基中，并能被NTA（N端tau）ELISA检测到。研究表明，ROS既可直接氧化tau（特别是甲硫氨酸残基），也可通过影响蛋白酶体（如PA28亚基）的活性来促进该片段的生成。
病理性tau片段改变tau聚集特性
体外硫黄素T（ThT）聚集实验和负染电镜观察表明，25 kDa tau片段的存在能延长全长tau蛋白聚集的延滞期，并改变最终形成的tau纤维的形态，使其更加挺直。
本研究通过系统性遗传筛选，在人iPSC源性神经元中揭示了tau蛋白稳态调控的新机制。研究首次发现CRL5SOCS4E3泛素连接酶复合物是tau蛋白的重要生理调控因子，可直接泛素化tau并促进其降解，该通路的功能与人类tau蛋白病中神经元的存活性相关。同时，研究揭示了线粒体功能障碍/氧化应激可通过影响蛋白酶体加工过程，诱导产生具有病理活性的N端tau片段（NTA-tau），该片段不仅本身可作为疾病生物标志物，还能改变tau的聚集特性。这些发现将细胞内蛋白降解系统（泛素-蛋白酶体系统）、能量代谢系统（线粒体氧化磷酸化）与tau病理紧密联系起来，为理解tau蛋白病的发病机制提供了新视角，并指出了CRL5SOCS4通路以及线粒体-氧化应激轴作为潜在治疗干预靶点的重要性。论文发表于《细胞》（Cell）杂志。
