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本研究利用单分子技术，揭示了复制因子C（RFC）在完成增殖细胞核抗原（PCNA）的装载后，其BRCT结构域介导形成稳定的钳装载复合物（CLC），该复合物能伴随PCNA在DNA上滑动，从而稳定PCNA与DNA聚合酶δ（Polδ）的相互作用，显著提升DNA填补合成的持续性。这一发现突破了RFC仅作为催化性钳装载器的传统认知，阐明了其在基因组维持中的重要非催化性结构功能。
DNA复制是生命体最核心的生命活动之一，其保真性和效率直接关系到基因组的稳定性。在这个过程中，一个名为增殖细胞核抗原（PCNA）的蛋白质扮演着至关重要的角色。PCNA是一个呈环状的三聚体蛋白，它能像一枚戒指一样套在DNA双链上，成为一个可滑动的“钳子”。这个钳子本身没有催化活性，但它能“拴住”真正的执行者——DNA聚合酶，极大地提高聚合酶合成DNA的能力和持续性，使其不会轻易从DNA模板上脱落。然而，闭合的PCNA环如何被准确地“戴”到DNA上，本身就是一个拓扑学难题。这个任务由另一个称为复制因子C（RFC）的五聚体蛋白复合物来完成。RFC利用水解ATP产生的能量，打开PCNA环并将其装载到DNA的特定位置（如带有3'凹陷末端的引物-模板接头）。传统的教科书模型认为，RFC在完成PCNA的装载后便会解离，将PCNA留在DNA上等待聚合酶的招募。
但是，真实的细胞过程往往比教科书模型更为精巧和复杂。近年来，有生化证据提示RFC与PCNA的相互作用可能更为持久。那么，RFC在完成其经典的“钳装载”使命后，真的就功成身退了吗？它是否会与PCNA在DNA上形成更稳定的复合物？如果会，这种持续的结合又有什么样的生物学功能？这些谜题亟待新的技术手段来解答。
为了直接“看见”RFC和PCNA在DNA上的动态行为，研究人员运用了一项强大的技术——单分子相关力与荧光显微镜。该技术结合了光镊（可操控单个DNA分子并测量微小作用力）和共聚焦荧光扫描（可实时观察被荧光标记的蛋白质在DNA上的移动），就像为分子世界安装了一个高清晰度的“摄影机”。
利用这一平台，研究人员首先在体外重构了一个包含单链DNA缺口的底物，模拟复制或修复过程中的DNA中间体。他们惊讶地发现，当RFC将荧光标记的PCNA装载到DNA上后，两者经常并不分离。相反，RFC和PCNA会形成一个稳定的复合物（研究人员称之为钳装载器/钳复合物，CLC），并一起在DNA双链区域进行一维扩散（滑动）。这与RFC在装载后立即解离的传统观点截然不同。进一步研究表明，这种CLC复合物的形成依赖于RFC中最大的亚基Rfc1所携带的一个BRCT结构域。当人为删除或突变该结构域中与DNA结合的关键氨基酸后（得到突变体RFCΔBRCT和RFC11A），虽然RFC仍能催化PCNA装载到DNA上，但它却无法与PCNA稳定结合形成CLC，会很快从DNA上被驱逐。更重要的是，由这些突变体RFC装载的PCNA在DNA上的移动速度显著更快，表明其与DNA的相互作用方式发生了改变。
接下来，研究团队探究了CLC复合物的功能意义。他们设计了更复杂的实验，在体系中加入了负责DNA合成的主力军——DNA聚合酶δ（Polδ），以及单链DNA结合蛋白RPA，实时观察蛋白质们如何协作，完成DNA缺口的“填补”合成。结果令人振奋：在野生型RFC存在的情况下，PCNA和RFC形成的CLC复合物能够与Polδ协同作用，伴随着DNA合成的进行，三者（或至少PCNA和RFC）能够作为一个整体稳定地沿着DNA移动，高效地完成长达数千个核苷酸的合成任务。然而，当使用无法形成CLC的RFCΔBRCT突变体时，DNA合成过程变得磕磕绊绊，频繁出现暂停。深入分析发现，一旦PCNA从正在合成DNA的3'末端滑离，Polδ也会随之脱落，合成反应即告中断；必须从溶液中重新招募一个Polδ分子，并在PCNA重新定位到3'末端后，合成才能继续。这表明，RFC通过形成CLC，扮演了一个“稳定支架”的角色，将PCNA“锚定”在聚合酶工作的前沿位置，从而保障了DNA合成的高度持续性。
那么，在细胞中，RFC的这种非催化功能是否同样重要呢？遗传学实验给出了肯定的答案。研究人员构建了携带相应rfc1基因突变（rfc1-BRCTΔ和 rfc1-11A）的酵母菌株。这些突变株对DNA甲基化试剂MMS表现出高度敏感，而对其他基因毒剂如HU或CPT则不敏感或敏感度较低，这表明RFC的BRCT结构域功能特异性地存在于应对某些类型的DNA损伤或复制压力。更进一步的遗传互作分析显示，这些RFC突变会与缺失其他重要DNA代谢蛋白（如瓣状内切酶FEN1、同源重组蛋白Rad51、检查点激酶Mec1、核糖核酸酶H等）的菌株产生“负遗传相互作用”，即双突变菌株的生长缺陷远比单突变严重，甚至导致死亡。这些遗传学特征与已知的滞后链合成缺陷菌株的表型高度相似，强有力地支持了RFC通过其BRCT结构域稳定PCNA-Polδ复合物，从而保障正常DNA复制的生理功能。
有趣的是，研究还发现另一个PCNA结合蛋白——FEN1，竟然可以“替代”RFC的这项结构功能。在体外，加入FEN1可以有效地挽救由RFCΔBRCT突变导致的DNA合成效率低下问题。这表明，在PCNA的“工具带”上，RFC和FEN1可能以冗余的方式发挥着稳定复制机器的非催化作用。这或许是一种巧妙的备份机制，确保了关键生命过程的鲁棒性。
本研究主要依托于几种关键的单分子和生物化学技术。首先是单分子光镊-荧光耦合技术，这是实时观测RFC、PCNA、Polδ等蛋白质在DNA上动态行为的核心手段。其次，研究人员运用了蛋白质质谱法来分析溶液中蛋白质复合物的分子量和组成。此外，标准的生物化学方法如凝胶过滤层析被用于分析PCNA在DNA上的装载效率。在遗传学部分，则采用了经典的酵母遗传学方法，包括基因敲除、点突变、斑点实验和四分体分析等，来验证RFC BRCT结构域的体内功能。
PCNA和RFC在双链DNA上形成长寿命的复合物并扩散
研究人员通过纯化并荧光标记酿酒酵母的PCNA和RFC，在光镊操控的含有缺口的DNA底物上进行观察。他们发现，在RFC和ATP存在下，能清晰观察到PCNA信号。出乎意料的是，RFC在完成PCNA装载后并未立即解离，而是经常与PCNA保持在DNA上结合，形成钳装载器/钳（CLC）复合物，并一起在DNA上滑动。
CLC可与DNA形成拓扑结合
实验表明，CLC复合物不仅能结合在带有缺口的DNA上，也能在完整的双链λ DNA上结合和滑动，表明其结合不绝对需要DNA末端。高盐挑战实验发现，约一半的CLC复合物能抵抗高盐洗脱并继续滑动，提示这部分复合物中的PCNA是以闭合环的形式拓扑环绕DNA的。
CLC的形成需要Rfc1的BRCT结构域
通过使用缺失BRCT结构域的RFC突变体（RFCΔBRCT）进行实验，发现该突变体虽能正常装载PCNA，但很少与PCNA在DNA上共定位，且由它装载的PCNA扩散系数显著更高。这表明Rfc1的BRCT结构域对于CLC在DNA上的稳定形成至关重要。
CLC与Polδ组装以促进DNA合成
在包含Polδ的DNA填补合成实验中，可频繁观察到PCNA和RFC保持关联，并伴随合成进程连续移动穿过DNA缺口。而在使用RFCΔBRCT时，RFC不再伴随PCNA移动，PCNA单独移动且合成过程频繁停顿。分析表明，PCNA离开合成前沿会导致Polδ脱落，需要重新招募新聚合酶才能继续合成，证实了RFC（通过CLC形式）在稳定PCNA-Polδ相互作用、保障合成持续性中的关键作用。
FEN1和RFC在DNA合成中共享非催化作用
研究发现，瓣状内切酶FEN1可以替代RFC，挽救RFCΔBRCT在支持持续性DNA合成方面的缺陷。竞争实验表明FEN1和RFC会竞争结合PCNA。这提示RFC和FEN1除了各自的催化功能外，在稳定PCNA-Polδ组装方面共享一种非催化性的结构功能。
BRCT结构域中的DNA结合残基对基因组维持很重要
体内遗传学实验表明，缺失BRCT结构域（rfc1-BRCTΔ）或突变其DNA结合残基（rfc1-11A）的酵母细胞对DNA损伤剂MMS敏感。这些突变与缺失FEN1（rad27Δ）、Rad51（rad51Δ）等基因的突变体表现出负遗传相互作用，表明Rfc1 BRCT结构域及其DNA结合能力对于基因组维持至关重要，其功能与滞后链合成等相关通路紧密关联。
本研究颠覆了对RFC功能的传统认知，揭示其除了催化PCNA装载这一经典角色外，还通过其Rfc1亚基的BRCT结构域，在PCNA装载后与之形成稳定的CLC复合物，并作为重要的结构支架，稳定PCNA与DNA聚合酶δ的相互作用，从而极大地促进了DNA合成的持续性。这项工作将RFC的功能从单一的“装载者”扩展到了“稳定者”，阐明了一种重要的非催化功能。同时，发现FEN1可以冗余地执行类似功能，提示PCNA结合蛋白可能普遍具有这类结构角色，这为理解DNA复制、修复机器的高度协调性和鲁棒性提供了新的框架。这些发现对于深入理解基因组稳定性维持机制以及相关疾病（如癌症）的发生发展具有重要的意义。该研究于2025年发表在《细胞》（Cell）杂志上。
