《Stem Cell Reports》：Histone methyltransferase Setd8 preserves chromatin accessibility to safeguard retinal progenitor cell identity during development
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本研究针对视网膜发育过程中维持祖细胞增殖和神经源性潜能的表观遗传机制尚不明确的问题，通过整合转录组和表观基因组分析，揭示了Setd8通过维持视网膜祖细胞特异性染色质开放性，从而保障其身份和正常发育的关键作用。该发现为视网膜再生医学提供了新的潜在靶点。
在脊椎动物视网膜发育过程中，六种主要的细胞类型（五种神经元和一种胶质细胞）从一个共同的视网膜祖细胞（Retinal Progenitor Cells, RPCs）以一种明确的时间顺序产生。然而，在整个视网膜细胞生成的最后阶段，维持RPCs增殖和神经源性潜能的表观遗传机制仍然知之甚少。尤其值得注意的是，Müller胶质细胞（Müller Glia, MG）作为最后从RPCs分化出来的细胞，与RPCs共享部分转录相似性，但成年小鼠的MG却缺乏神经源性潜能，即使在视网膜损伤条件下也是如此。过去十年的广泛研究探索了通过过表达转录因子（如Ascl1）将MG重编程为视网膜神经元的策略，但将MG重编程为多能性RPC样细胞仍然具有挑战性。因此，识别调控RPCs中祖细胞能力的表观遗传机制，特别是该调控网络中的核心因子，对于理解如何维持RPC身份至关重要。这些知识可能实现对MG进行靶向操作，将其重编程为多能性RPC样细胞，从而推动视网膜再生医学的进展。
为了回答这些问题，研究人员在《Stem Cell Reports》上发表了题为“Histone methyltransferase Setd8 preserves chromatin accessibility to safeguard retinal progenitor cell identity during development”的研究。该研究整合了RNA测序（RNA-seq）和转座酶可及染色质测序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing, ATAC-seq），分析了从Nestin-EGFP小鼠中分离的EGFP阳性胚胎RPCs。研究人员首先确认了Nestin（Nes）在发育中的视网膜RPCs中的特异性表达，并利用Nestin-EGFP小鼠标记和分离了发育中视网膜的RPCs。通过荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）分离了E14和E17胚胎视网膜中的EGFP阳性（Nestin-EGFP+）RPCs。整合转录组分析显示，RPCs在整个发育过程中维持着特定的基因表达网络和染色质可及性景观。研究人员进一步筛选出在RPCs中持续高表达而在分化细胞中低表达的表观遗传调控因子，并将研究焦点集中在组蛋白甲基转移酶Setd8上，该酶催化组蛋白H4第20位赖氨酸的单甲基化（H4K20me1）。通过构建RPCs特异性Setd8条件性基因敲除（conditional Knockout, cKO）小鼠模型，并结合细胞命运图谱追踪，研究人员深入探究了Setd8在视网膜发育中的功能。
本研究主要应用了以下关键技术方法：利用Nestin-EGFP转基因小鼠和荧光激活细胞分选技术（FACS）分离纯化胚胎期（E14, E17）和出生后（P0）的视网膜祖细胞；对纯化细胞进行RNA测序（RNA-seq）和转座酶可及染色质测序（ATAC-seq），进行整合转录组和表观基因组分析；构建并利用Nestin-CreERT2; Setd8flox/flox; Rosa26-YFP条件性基因敲除（cKO）小鼠模型，通过他莫昔芬（Tamoxifen）诱导在特定时间点（E17.5）敲除Setd8，并利用YFP报告基因进行细胞命运追踪；通过免疫组织化学染色、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）及活性半胱天冬酶-3（active caspase-3）染色等技术，评估细胞增殖、DNA损伤和凋亡情况。
RPCs在整个发育过程中保留特定的基因表达网络
研究人员通过整合分析本研究和公共数据库的转录组数据，发现RPCs在发育过程中维持着独特的转录特征。k-means聚类分析将基因分为四个主要簇。其中，簇D包含了对于细胞增殖至关重要的基因（如Ccnd1, Cdk4, Fgf15），这些基因在RPCs中强表达，而在成年MG中弱表达，提示它们在维持RPC身份和神经源性潜能中发挥作用。
RPCs在胚胎发育过程中维持特定的染色质景观
ATAC-seq分析揭示了RPCs在发育过程中具有独特的染色质可及性动态。聚类分析显示，簇D包含了在RPCs中特异性可及的染色质区域，这些区域富集了调控RPC活性和神经发生的转录因子结合位点，如Meis1, Meis2, Neurog2, NeuroD1和Ascl1。此外，虽然E14和E17之间约有60%的染色质可及性区域是共享的，但也存在阶段特异性的变化，例如E17时与MG分化相关的因子（如NFIX）的基序可及性增加。
Setd8缺失限制视网膜祖细胞能力
研究人员从高表达于RPCs而非MG的表观遗传因子中筛选出Setd8进行功能研究。通过在E17.5诱导Setd8 cKO，发现其在P15时导致眼轴缩短、视网膜内核层（INL）和外核层（ONL）变薄。具体而言，晚期出生的细胞类型，如无长突细胞（ACs）、双极细胞（BCs）和Müller胶质细胞（MG）数量显著减少，而早期出生的细胞（如视网膜神经节细胞RGCs、水平细胞HCs）未受影响。细胞命运追踪显示，Setd8缺失主要减少了YFP阳性细胞的总数，但并不改变各细胞类型在YFP阳性细胞中的比例，表明Setd8缺失主要影响RPC的增殖，而非细胞命运特化。
Setd8缺陷抑制RPC增殖并促进凋亡
EdU掺入实验显示，Setd8 cKO视网膜中，YFP阳性细胞中EdU阳性的比例在P0呈下降趋势，在P2则显著降低，表明Setd8对于维持RPC增殖至关重要。同时，Setd8缺失导致DNA损伤标志物γH2AX阳性细胞和凋亡标志物活性caspase-3阳性细胞显著增加，提示Setd8在防止RPC凋亡中也发挥关键作用。
Setd8维持RPC特异性转录组
对P0时分离的YFP阳性细胞进行RNA-seq分析发现，Setd8缺失导致509个基因表达差异，其中330个上调，179个下调。基因集富集分析（GSEA）显示，DNA修复相关通路在Setd8 cKO细胞中显著下调。同时，调控RPC祖细胞能力的关键因子，如Ascl1, Sox2, Sox3和Hes1的表达也显著降低。这些结果表明Setd8对于维持RPC身份、支持祖细胞能力和保护细胞免于异常分化和死亡至关重要。
Setd8维持RPC特异性染色质可及性
ATAC-seq分析显示，Setd8缺失使P0时RPCs的染色质可及性状态更接近于MG。差异可及区域（Differentially Accessible Regions, DARs）分析发现，29.3%的区域在Setd8 cKO中可及性降低（获得性关闭），而仅有0.1%的区域可及性增加（获得性开放）。这些可及性降低的区域富集了Ascl1, Meis2, NeuroD1等RPC关键因子的结合基序。此外，整合公共ChIP-seq数据发现，表观遗传调控因子如Ezh2, Suz12, Mecp2和Tet1优先占据这些可及性降低的区域。Setd8缺失还导致Rad54b, Hes1, Ascl1和Sox3等基因附近位点的染色质可及性降低。这些发现表明，Setd8可能通过与这些表观遗传因子协作，来维持RPC特异性的染色质可及性。
本研究通过整合多组学分析，定义了表征RPC特性的基因表达和染色质可及性景观，并揭示了Setd8在其中的核心作用。研究表明，Setd8通过维持RPC特异性的染色质开放性，保障了关键转录因子网络的正常表达，从而确保RPCs的增殖能力、基因组稳定性和正常的发育进程。Setd8的缺失会导致染色质可及性向MG状态偏移，并引发DNA损伤、细胞凋亡以及晚期视网膜细胞生成的严重缺陷。这些发现不仅深化了对视网膜发育中表观遗传调控机制的理解，而且为通过操纵关键表观遗传因子（如Setd8）来重编程MG、实现视网膜神经再生提供了重要的理论依据和潜在的干预靶点。由于某些表观遗传修饰具有潜在的可逆性，这些发现为可能重新激活MG中RPC样表观遗传状态的策略提供了见解，从而有助于视网膜再生方法的发展。
