美国犹他州果园中果蝇及其周围环境的微生物群组成

《Microbiology Resource Announcements》：Microbiota composition of Drosophila and their environments in Utah, USA, orchards

果蝇及其水果、土壤环境的微生物群研究显示，野生果蝇的微生物组成随犹他州纬度梯度显著变化，性别、饥饿状态和样本基质（水果/土壤）是主要驱动因素，其中醋酸杆菌属、葡萄糖球菌属等差异显著，揭示了地理和生态因素对果蝇微生物群落的动态影响。

　　

摘要

我们研究了在美国犹他州不同纬度地区收集的果蝇及其栖息地（包括果实和土壤）中的微生物群落，并对这些微生物群落进行了标记基因分析。样本的差异体现在果蝇种类、性别和饥饿状态上，这为我们提供了这些因素与野外微生物群落组成之间相互关系的初步了解。

公告

为了更好地理解果蝇（Drosophila melanogaster）的微生物群落组成、纬度及其生活史之间的关系，我们在美国犹他州的不同纬度地区收集并分析了果蝇的微生物群落。一些饥饿状态的雄性果蝇样本在另一篇文章中有所报道（1），其余609个样本则在此报告。

2020年秋季，我们在美国犹他州的五个果园进行了采样（参考文献1中的表S10）。在每个果园的7-13个地点，我们使用空中网捕捉了5-15只掉落的果蝇，同时采集了腐烂和新鲜桃子的组织样本（1/4英寸×1/2英寸）以及土壤样本（1/2英寸×3/4英寸）。样本立即被储存在干冰上，或者对于部分样本，先让其饥饿约4小时，然后再长期储存在-80°C环境中。通过显微镜检查每只果蝇，仅保留果蝇（Drosophila melanogaster）和模拟果蝇（Drosophila simulans），依据既定标准进行鉴定（2–4），例如雄性模拟果蝇具有明显的生殖弓结构，而雌性则具有不同的色素带特征。雌性的形态差异并不具有决定性，因此在解释时应谨慎。

所有样本处理步骤均遵循制造商的说明，除非另有说明。DNA提取使用的是Zymo Quick-DNA Fecal/Soil Microbe 96试剂盒（D6011）。将单只果蝇、20毫克土壤或50毫克桃子组织放入96孔匀浆管中，在SPEX GenoGrinder上以1,750 RPM的速度匀浆2分钟。16S rRNA V4标记基因的测序采用了双重条形码技术（5）。PCR反应经过Just-a-Plate标准化试剂盒（Charm Biotech, JN-120-10）进行归一化处理，并将结果合并（每组96个样本），随后使用Zymo gDNA Clean & Concentrator 11-302C进行浓缩。选择250-450 bp的DNA片段，使用Illumina MiSeq 500 Cycle v.2试剂盒进行测序。两次独立测序共获得了1610万个符合Illumina质量标准的读段。

序列经过去噪、去重复处理，并被分类为扩增子序列变异类型，OTU表的使用方法如前所述，通过QIIME2 2022.11和DADA2软件完成，所有参数均采用默认设置（1–13）。分类鉴定使用GreenGenes 13_8_99软件进行（8）。在去除之前报道过的样本或与本研究无关的样本后（分别在去除Wolbachia读段之前/之后），最终得到609个样本中的12,860,107/2,833,611个有效读段（最小值6/2；最大值194,940/194,715；中位数13,129/745；平均值21,117/4,723）（图1）。Bray–Curtis距离受采样地点、基质、果蝇种类、性别和饥饿状态的影响（表1）。ACOM分析揭示了不同条件下的细菌属差异（14）（表1）。这些来自果实、土壤和果蝇的样本进一步揭示了野生果蝇微生物群落组成受饮食和地理因素的影响。

图1

图1 野生果蝇及其栖息地中的微生物群落组成。读段被稀疏至每个样本146个，按属进行聚类，并根据元数据进行聚合。总体丰度低于1.5%的属被归类为“其他”类别。插图显示了土壤样本的门级分类结果，这些样本的读段首先被稀疏至每个样本8,300个。

表1

表1 PERMANOVA和ACOM分析结果

	自由度（Df）	平方和（SS）	卡方值（R2）	F值	P值	ACOM分析显示有显著差异的属
所有样本
基质	2	7.31	0.04	10.51	10?3	Acetobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, 未分类的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）
地点	4	19.05	0.1	13.69	10?3	Gluconobacter, Komagataeibacter, 未分类的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、未分类的乳杆菌科（Lactobacillaceae）、未分类的巴斯德氏菌目（Pasteurellales）
残差	473	164.57	0.86
总计	479	190.94	1
果蝇样本
种类	1	0.84	0.01	2.67	10?3	无显著差异
饥饿状态	1	6.04	0.04	19.19	10?3	Acetobacter, Gluconobacter, 未分类的乳杆菌科（Lactobacillaceae）
性别	1	5.75	0.04	18.25	10?3	Acetobacter
地点	4	17.12	0.11	13.59	10?3	Gluconobacter, Komagataeibacter, Leuconostoc, 未分类的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、未分类的乳杆菌科（Lactobacillaceae）、未分类的巴斯德氏菌目（Pasteurellales）
残差	407	128.17	0.81
总计	414	157.93	1

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences）的资助，资助编号为R15GM140388。

本文内容仅代表作者观点，不一定代表美国国立卫生研究院的官方立场。