《Bioorganic Chemistry》：Investigating the epigenetic modulating potential of gallic acid during ethanol-induced toxicity:
In silico and
in vitro approaches
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乙醇诱导肝毒性机制及鞣花酸防护作用研究。采用WRL 68细胞急性（24h）和慢性（14d）乙醇暴露模型，发现30μM GA通过维持抗氧化酶活性（SOD、CAT、GSH、TBARS）及调控miRNA表达（如upregulation miR_199a_5p、miR_26b_5p；downregulation miR_21_5p、miR_17_5p）平衡表观遗传修饰，抑制凋亡基因（Cas3、Cas9、Bax）表达，有效缓解乙醇引起的氧化应激、DNA损伤及上皮间质转化（EMT）。摘要分隔符：
Rubin Nishanth Armstrong | Krithika Narayanan | Maheshvare Natesan | Suresh Senthilkumar | Shalini Rajakumar | Sakthi Sree Karthikeyan | Yamunarani Alagudurai | Devipriya Nagarajan | Rekha Arcot | Naiyf S. Alharbi | Muthu Thiruvengadam
印度泰米尔纳德邦Thanjavur市SASTRA大学化学与生物技术学院，邮编613401
摘要
与酒精相关的疾病在全球范围内显著增加了发病率、死亡率和经济负担。过量饮酒几乎会影响所有器官，尤其是肝脏、肠道和肾脏，因为在代谢过程中会产生过多的自由基，这些自由基会破坏细胞的表观遗传稳态，从而导致疾病的发生。治疗酒精引起的毒性的有效策略之一是使用免疫抑制剂和皮质类固醇，但这些方法存在许多副作用。因此，寻找成本低廉、毒性低的天然产物来治疗酒精相关性肝脏疾病越来越受到关注。此外，氧化应激引起的表观遗传失调与乙醇引起的毒性之间的机制关系仍不清楚。基于这些背景，我们研究了没食子酸（GA）对乙醇诱导的肝毒性的保护作用。WRL 68细胞在两种不同条件下（急性暴露24小时和慢性暴露14天）接受了乙醇和GA的处理。30 μM的GA通过维持SOD、CAT、GSH和TBARS的水平来保护细胞免受氧化应激的影响。在急性乙醇暴露下，GA显著下调了miR_21_5p、miR_17_5p、HAT和HDM的表达，同时上调了miR_199a_5p、miR_129_5p、miR_26b_5p、HDACs和HMTs的表达。GA还通过抑制凋亡基因（Cas 3、Cas 9和Bax）的表达，保持了DNA的完整性并防止细胞发生凋亡。在慢性乙醇暴露下，GA通过维持细胞的表观遗传平衡，减缓了WRL 68细胞的EMT（上皮间质转化）进程。根据我们的研究结果，GA可以作为抗氧化剂，在乙醇暴露期间保护细胞免受表观遗传失调的影响。然而，为了进一步了解GA在维持细胞表观遗传平衡中的机制作用，还需要进行更多的分析，如蛋白质表达谱分析和ChIP实验。
引言
尽管健康意识日益增强，但由于社会动态和心理因素的影响，全球酒精消费量仍然很高。现代的消费模式显示了文化规范、压力管理和全球化之间的复杂相互作用[32]。酒精消费与多种健康问题相关，几乎会影响身体的每一个器官。长期饮酒会增加患肝脏疾病的风险，如肝硬化、酒精性肝炎、脂肪肝和肝癌。作为一种已知的致癌物，酒精与肝脏、直肠、结肠、乳腺和口腔癌密切相关[51]。由于肝脏是代谢和解毒的核心器官，因此容易受到酒精代谢引起的氧化损伤[37]。乙醇通过一个双相机制诱导氧化应激：在代谢前阶段，乙醇通过激活CYP2E1和上调NADPH氧化酶直接刺激ROS（活性氧）的产生[33]；在代谢后阶段，乙醇的代谢产物乙醛会形成DNA和蛋白质加合物，影响抗氧化防御系统[34]。
Kar等人[25]评估了乙醇对成纤维细胞行为的剂量依赖性影响。他们的研究表明，酒精暴露会诱导氧化应激，这通过TBARS和蛋白质氧化等氧化应激标志物的表达增加得到了验证。在高浓度乙醇下，成纤维细胞的增殖、ATP产生和细胞活性显著受损。Li等人[29]研究了乙醇对大鼠肝细胞BRL-3A的肝毒性作用，发现乙醇暴露会导致细胞存活率下降、细胞死亡和凋亡。此外，乙醇还会增加细胞中LDH的释放，进一步证实了其毒性。乙醇还破坏了Nrf2的转位，削弱了细胞的抗氧化防御机制，导致抗氧化酶活性降低。Yuan等人在人类肝细胞中的研究证实，乙醇处理会诱导氧化应激，导致线粒体膜电位丧失。乙醇通过激活Bax的转位和细胞色素c从线粒体中的释放，引发凋亡途径，从而降低细胞存活率。此外，乙醇还会扰乱细胞稳态并改变自噬过程，促进脂质过氧化。
表观遗传修饰是指基因表达的可遗传变化，但不会改变DNA序列。表观遗传修饰在基因表达调控中起着重要作用。主要的表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰（乙酰化和甲基化）和非编码RNA（miRNA）[58]。组蛋白修饰酶通过改变染色质结构来调节基因表达。HAT酶将乙酰基从乙酰辅酶A转移到组蛋白的赖氨酸残基上，使染色质带负电荷增加并变得松散，从而使DNA更容易被转录因子结合[53]。HDAC酶则从组蛋白残基上去除乙酰基，恢复染色质的正电荷并使其凝聚，从而抑制转录。组蛋白甲基转移酶（如G9a和EZH2）分别甲基化H3K9和H3K27残基，使染色质更加凝聚，抑制基因表达。LSD是一种赖氨酸特异性去甲基化酶，可以从组蛋白残基上去除甲基，从而使染色质松散，促进转录上调[42]。酒精引起的氧化应激可以导致组蛋白修饰（乙酰化和甲基化），并影响miRNA的表达，进而影响目标基因的表达[19]。
管理酒精相关性肝脏疾病最有效的策略之一是戒酒；然而，长期坚持戒酒往往具有挑战性。目前的药物治疗方法包括皮质类固醇和免疫抑制剂，但效果有限，副作用较多，患者反应不佳，有时甚至需要通过肝脏移植来解决问题[3]。这些局限性凸显了开发更安全、更有效疗法的迫切需求。最近，基于天然产物的治疗方法受到关注，因为它们具有抗氧化、抗炎和免疫调节等多种潜在功效。在我们的研究中，我们使用了没食子酸（GA），这是一种天然存在于许多蔬菜和水果中的多酚化合物，由于其苯环上含有三个羟基，被认为具有很强的抗氧化活性。GA还具有多种治疗作用，如抗炎和抗血管生成作用[22]。羟基的存在使GA能够有效捐赠氢原子，中和产生的自由基，从而减轻氧化应激并保护细胞免受损伤。体外和体内实验表明，GA具有很强的自由基清除能力，能有效中和DPPH、ABTS和羟基自由基等自由基，其效果通常优于标准抗氧化剂。GA还能抑制TBARS的生成，提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的活性，有助于维持氧化还原平衡[23]。Zhou等人[59]研究了GA对乙醇诱导的肝细胞坏死的保护作用，发现GA激活了Nrf2信号通路，该通路能调节抗氧化基因的表达，从而减少细胞死亡并改善氧化还原稳态[17]。他们还研究了tBHP诱导的氧化应激，发现GA处理后抗氧化酶（如血红素加氧酶-1）的表达增加，GSH水平升高。这些效应是通过ERK-Nrf2-Keap1通路介导的，进一步强调了GA在增强细胞抗氧化防御系统中的作用。这些细胞保护特性表明GA是一种有效的抗氧化化合物，可用于减轻氧化应激引起的毒性。
目前关于miRNA和组蛋白修饰因子在急性和慢性酒精暴露中的作用的研究还不够充分，针对GA对酒精诱导的肝毒性的疗效研究也很少，主要集中在表观遗传网络方面。基于上述背景，本研究旨在（1）了解乙醇诱导的肝毒性的分子机制，重点关注氧化应激介导的表观遗传修饰和miRNA失调；（2）评估GA在急性及慢性酒精暴露下对转化肝细胞系WRL 68的细胞保护作用。通过结合细胞实验、基因表达分析和计算机模拟（In silico）对接技术，本研究旨在阐明乙醇驱动的调控机制，并评估GA是否可以通过恢复氧化还原平衡和转录后修饰来减轻乙醇引起的肝毒性。
绝对乙醇（纯度99.9%，Zenith Biochemicals）和没食子酸（编号42306，纯度至少98%，SRL Chemicals）。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，编号AL007A）、胰蛋白酶（编号TCL006）和胎牛血清（FBS，编号RM10951）购自HiMedia；MTT试剂（编号M2128，纯度98%，Sigma Aldrich）。其他所有化学品和试剂均购自SRL Chemicals、HiMedia或Sigma-Aldrich。
转化肝细胞系WRL 68来源于国家细胞科学中心
在第一阶段研究中，我们考察了急性乙醇暴露对WRL 68细胞的影响。该研究主要目的是探讨乙醇暴露对细胞存活率、氧化应激、表观遗传修饰和DNA损伤的剂量依赖性影响。
本研究探讨了GA在减轻乙醇暴露引起的氧化应激和表观遗传修饰中的作用。使用MTT实验评估了乙醇在WRL 68细胞中的毒性，乙醇浓度范围为100至500 mM。发现乙醇的IC50浓度（抑制细胞生长50%的浓度）为300 mM，该浓度被用于后续研究。同时，也通过MTT实验评估了GA的细胞保护作用。
我们的研究表明，乙醇引起的氧化应激是导致表观遗传失调、细胞凋亡、炎症和EMT（上皮间质转化）进程的关键因素，而GA能有效缓解这些效应。急性乙醇暴露会损害抗氧化防御机制，改变miRNA表达，破坏组蛋白修饰酶的平衡，激活线粒体介导的凋亡途径，并引起DNA损伤。GA显著恢复了氧化还原平衡，保持了表观遗传稳态。
Muthu Thiruvengadam：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、实验设计和概念构思。
所有作者均同意本文的发表。
本文不涉及任何作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。
本研究由印度泰米尔纳德邦Thanjavur市SASTRA大学的T. R. Rajagopalan研究基金（SASTRA-TRR-SCBT-3-04042025）资助。
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作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
