《Bioresource Technology》：Membrane and co-culture engineering for high-level curcumin production in
Escherichia coli
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微生物合成姜黄素策略研究中，利用大肠杆菌构建集成分子伴侣辅助酶折叠、外膜囊泡介导分泌及模块化共培养工程的微生物平台，显著提升产量至978 mg/L/L，为亲脂性天然产物生产提供新范式。
石一阳|史同|于京华|沈晓琳|王佳|孙欣晓|袁启鹏
北京化工大学化学资源工程国家重点实验室，北京 100029，中国
摘要
姜黄素类化合物是Curcuma longa的主要生物活性成分，具有广泛的药理活性，包括抗癌、抗氧化和抗炎作用，因此在制药、营养补充剂和化妆品领域具有广泛应用价值。微生物生物合成提供了一种可持续的替代方法。然而，由于酶表达效率低下以及姜黄素类化合物本身的疏水性，导致其在细胞内积累并引发代谢压力，从而限制了其生产效率。本文开发了一种微生物平台，该平台利用分子伴侣辅助的酶折叠机制、外膜囊泡（OMV）介导的分泌过程以及模块化共培养技术来提高大肠杆菌中姜黄素类化合物的产量。分子伴侣的共表达提高了植物来源的姜黄素合成酶的溶解性和催化性能，而OMV系统则有助于疏水性产物的部分输出，减轻了细胞的负担。通过将生物合成途径分为上游的阿魏酸合成模块和下游的姜黄素合成模块，并实施基于碳源的代谢分配策略，我们在3升 fed-batch 生物反应器中实现了978毫克/升的姜黄素产量，这是迄今为止报道的最高产量。我们的工作为疏水性天然产物的微生物合成建立了一个通用框架。
引言
姜黄素类化合物是Curcuma longa（姜黄）的主要生物活性成分，是一类橙黄色、亲脂性的酚类化合物，包括姜黄素、去甲氧姜黄素和双去甲氧姜黄素（Ahsan等人，1999年；Rodrigues等人，2015年）。由于其多样的药理特性，如抗癌（Sharma等人，2005年；Yallapu等人，2013年）、抗氧化（Li等人，2020年；Motterlini等人，2000年）和抗炎作用（Hasanzadeh等人，2020年；Kumar等人，2010年），姜黄素类化合物在食品、制药和化妆品行业得到广泛应用。传统的姜黄素类化合物生产方法依赖于从姜黄植物中提取和纯化（Insuan等人，2022年；Pan等人，2020年）。然而，这种方法受到地理和气候条件限制、提取效率低以及环境影响较大的问题。这些问题促使人们转向微生物生物合成这一可持续且环保的替代方案（Chemler和Koffas，2008年；Martin等人，2003年）。
姜黄素类化合物已在大肠杆菌和酿酒酵母等微生物宿主中实现异源生产（Katsuyama等人，2011年；Katsuyama等人，2009a年；Tan等人，2020年）。其生物合成途径始于l-酪氨酸，首先通过酪氨酸氨裂解酶将其转化为p-香豆酸。该化合物随后被羟基化和甲基化生成阿魏酸。接下来，4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）激活阿魏酸或p-香豆酸，而二酮酸-CoA合成酶（DCS）进一步延长链长以生成二酮酸-CoA中间体。最后，姜黄素合成酶将这些二酮酸与阿魏酰-CoA或p-香豆酰-CoA缩合，生成多种姜黄素类化合物（图1A）。在这一经典框架的基础上，人们在提高产量方面取得了显著进展，包括酶的筛选（Katsuyama等人，2009b年；Morita等人，2010年；Ramirez-Ahumada等人，2006年）、优化姜黄素合成酶的表达（Kim等人，2017年）、改变代谢流方向以避开竞争途径以及增强丙二酰-CoA的供应（Chu等人，2020年；Kan等人，2019年）。这些努力共同提高了产量。通过其他策略，如删除内源性姜黄素还原酶（Wu等人，2020年）、平衡前体物质的供应（Incha等人，2020年；Kang等人，2018年；Katsuyama等人，2010年；Trantas等人，2009年）、优化发酵条件（Couto等人，2017年；Fang等人，2018年）以及表达耐溶剂泵（例如srpB）以减轻中间产物的毒性（Chen等人，2024年），进一步提高了生产效率。值得注意的是，在5升规模的试验性发酵中，这些综合方法使大肠杆菌中的姜黄素产量达到了696.2毫克/升（Chen等人，2024年）。这些进展既展示了微生物合成疏水性天然产物的潜力，也凸显了其中存在的持续挑战，因此需要开发新的策略来减轻代谢负担并管理代谢途径的复杂性。
一个主要瓶颈是姜黄素类化合物本身的疏水性。与其他疏水性天然产物（如类胡萝卜素）类似，它们倾向于在细胞膜内积聚（Wu等人，2017年），这限制了产量，导致代谢压力并影响细胞活力。传统的运输系统在输送这类亲脂性分子方面效率较低。大肠杆菌能够自然产生外膜囊泡（OMVs）（Kulp和Kuehn，2010年；Schwechheimer和Kuehn，2015年）。这些纳米级囊泡在扩展细菌与环境的界面方面发挥着重要作用，并具有封装和分子运输的能力。OMVs能够促进蛋白质分泌（Lappann等人，2013年；Olofsson等人，2010年；Yu和Kim，2012年）、适应压力（Macdonald和Kuehn，2013年；McBroom和Kuehn，2007年；Toyofuku等人，2014年）、微生物群落相互作用以及脂质交换（Berleman等人，2014年；Biller等人，2014年；Elhenawy等人，2014年）。它们还能保护毒力因子免受降解，并实现靶向货物输送（Haurat等人，2011年；Maredia等人，2012年；Roden等人，2012年）。受到这些天然功能的启发，我们假设OMVs可以作为一种生物载体，用于分泌姜黄素类化合物等疏水性代谢物。
尽管工程化单菌培养已成功生产出许多有价值的化学品，但其对于姜黄素类化合物等分子的代谢能力仍存在固有限制（Li等人，2022年）。为克服这一问题，我们采用了模块化共培养策略，将生物合成途径分为两个专门的菌株：一个用于阿魏酸合成，另一个用于姜黄素类化合物的组装。这种分工减轻了代谢负担并提高了整体代谢效率。为确保共培养的稳定性，我们进一步分离了碳源的利用，从而减少了发酵过程中的竞争。
基于这一模块化框架，我们开发了一种综合策略，结合了伴侣辅助的酶折叠和OMV介导的分泌过程。具体来说，我们共表达了分子伴侣以纠正酶的折叠并提高植物来源酶的活性（Holtz等人，2024年），并设计了基于OMV的分泌系统，将疏水性姜黄素类化合物导入囊泡结构中，从而缓解了细胞内的积累和代谢压力（Gunes等人，2016年）。这些努力使得在3升生物反应器中最终获得了978毫克/升的姜黄素产量——这是迄今为止报道的最高产量。这项工作不仅建立了一个高效的微生物生产姜黄素类化合物的平台，还为疏水性天然产物生物合成中的细胞内积累问题提供了通用解决方案。
菌株和质粒
本研究涉及的所有菌株和质粒列在补充表S1和S2中。基因整合和敲除采用CRISPR/Cas9技术按照标准协议进行（Yu等人，2015年）。高拷贝数的pZE12-luc和中拷贝数的pCS27用于合成途径的构建。质粒pETDuet-1用于蛋白质的表达和纯化。这些质粒是使用标准的酶切和连接方法构建的（Cohen等人，1973年）。
通过共表达分子伴侣提高DCS的溶解性
在大肠杆菌中重建姜黄素类化合物的生物合成过程，关键植物来源酶——二酮酸-CoA合成酶（DCS）和姜黄素合成酶1（CURS1）的功能性表达至关重要。然而，由于蛋白质的稳定性较低以及细菌宿主内部的独特细胞环境，这些酶的异源表达常常导致错误折叠和聚集。
我们首先在大肠杆菌 BL21(DE3)中评估了这些酶的表达情况...
结论
姜黄作为一种高价值的天然酚类化合物，具有广泛的应用前景。为了解决微生物生产姜黄素过程中遇到的关键瓶颈，如酶溶解性差和产物在细胞内积累问题，我们在大肠杆菌中实施了伴侣辅助的酶折叠和OMV介导的分泌策略。这一方法使姜黄素的产量提高了13.7倍。此外，通过将生物合成途径模块化为一个稳定的共培养系统，并优化碳源的利用，我们进一步减少了代谢负担...
未引用的参考文献
CRediT作者贡献声明
石一阳：撰写——初稿、方法学设计、实验研究、数据分析。史同：资源提供、数据分析。于京华：资源提供、数据管理。沈晓琳：撰写——审稿与编辑。王佳：撰写——审稿与编辑。孙欣晓：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金筹措、概念构思。袁启鹏：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金筹措、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有可能影响本文研究的财务利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2024YFF1106400）和国家自然科学基金（22322802、32271488、22238001）的支持。
