提高生物乙醇产量：纳米Fe?O?、接种剂、大型语言模型辅助的添加剂优化方法及其经济意义

《Bioresource Technology Reports》：Enhancing bioethanol production: Synergistic effects of nano-Fe 3O 4, inoculum, large language model-assisted additive optimization and economic implications

生物乙醇生产通过Fe3O4纳米颗粒接种物及抗氧化剂/表面活性剂协同优化研究。采用响应面法（RSM）优化纳米颗粒浓度（0-0.1wt%）、温度（28-30℃）及作用时间（12-18h），结合CD-RAG LLM辅助的抗氧化剂（抗坏血酸）和表面活性剂（Tween-80）协同作用，显著提升酵母特异性生长速率（13%）和生物量浓度（8%），发酵性能提高超55%。经济评估显示该策略具有 shorter payback time (<10年) 和 higher processing capacity 的商业潜力。

　　

Sinenhlanhla L. Mweli|Isaac A. Sanusi|Lorika S. Beukes|Gueguim E.B. Kana

南非夸祖鲁-纳塔尔大学，农业与科学学院，彼得马里茨堡

摘要

本研究提出了一种新方法，通过基于纳米技术的S. cerevisiae接种剂开发、抗氧化剂（抗坏血酸）和表面活性剂（Tween-80）的添加来提高生物乙醇的产量。首先使用响应面方法（RSM）对Fe₃O₄纳米颗粒（0–0.1?wt%）、温度（28–30?°C）和暴露时间（12–18?h）对S. cerevisiae的特定生长率和生物量浓度进行建模，以优化生物乙醇的生产。实验验证结果显示，特定生长率为0.234?±?0.019?h^?1，生物量浓度为3.395?±?0.102?g/L，分别比对照组提高了13%和8%。优化后的接种剂在预处理过的马铃薯残渣上的发酵性能（>55%）得到了提升。此外，使用基于上下文的检索增强生成（CD-RAG）大型语言模型（LLM）协助优化了Tween-80和抗坏血酸的添加，使特定生长率提高了1.16倍，生物量浓度提高了1.11倍。对该接种剂开发策略的经济评估表明，这是一种具有潜在盈利性的方法，可以在较短的回收时间内（<10年）实现更高的生物乙醇生产能力。这些发现为利用Fe₃O₄纳米颗粒和CD-RAG LLM提高生物乙醇产量提供了宝贵的见解。

引言

化石燃料的消耗与温室气体的排放及其环境影响有关（Canabarro等人，2023年；Sharma和Sharma，2023年）。因此，人们对替代燃料（如生物燃料）的兴趣日益增加（Tse等人，2021年；Veza等人，2023年）。生物乙醇被认为是一种可行的生物燃料，这从全球生物乙醇产量的增长中可以得到证实。从21世纪初的180亿升增加到2019年的1100亿升，再到2024年的1180亿升（Tse等人，2021年；Hoang和Nghiem，2021年；Sharma等人，2024年）。

生物乙醇的生产主要依赖于Saccharomyces酵母菌株，尤其是Saccharomyces cerevisiae，因为它们具有较低的pH耐受性、较高的发酵能力以及能够在高生物乙醇浓度下存活（Lip等人，2020年；Bordet等人，2024年）。不同类型的Saccharomyces cerevisiae菌株所能耐受的生物乙醇浓度从工业菌株的20–21%到实验室菌株的7.5–10%不等（Bordet等人，2024年；Zhang等人，2024年）。然而，当前的生物乙醇生产面临一些问题，这些问题影响了生物乙醇生产微生物的生物活性，从而影响了酵母菌株在特定工艺参数下的发酵性能和效率（Talasila和Vechalapu，2014年）。

为了克服这些挑战，提高S. cerevisiae生产生物乙醇的总体效率，开发出强大且性能优异的接种剂至关重要（Sanusi等人，2019年）。接种剂的开发包括选择、适应、优化和逐步放大微生物菌株，以实现高水平的活性和代谢活跃的接种剂，从而提高发酵性能（Sood等人，2011年）。目前尚未有关于使用纳米颗粒（NPs）如Fe₃O₄纳米颗粒来提高生物乙醇产量的报道。

此外，关于在培养基配方中添加纳米颗粒（NPs）如Fe₃O₄纳米颗粒以增强发酵酵母菌株的生物活性并提高发酵效率的研究也很少（Ghalkhani等人，2023年；Ndaba等人，2025年）。Fe₃O₄纳米颗粒在生物加工中的应用得益于其独特的性质，例如优异的磁性（可重复使用）、生物相容性（与其他纳米材料相比毒性较低）、高表面积与体积比（增强催化活性）、易于表面功能化以及刺激代谢活动和生长的潜力（Volpi等人，2023年；Trisnaliani等人，2024年）。这些性质通过改善质量和热传递、促进电子转移以及增强酶和细胞代谢活性来提高工艺效率（Dutta等人，2023年）。在生物加工中添加NPs还可以通过改变微生物代谢途径和改善底物利用来提高生物乙醇产量（Rashtbari等人，2022年；Dutta等人，2023年）。

此外，研究表明Fe?O?纳米颗粒可以通过内吞作用在S. cerevisiae中积累，导致细胞内氧化应激（如活性氧物种（ROS）的增加（Luo等人，2019年），从而降低其在生物加工中的催化潜力，尤其是在高浓度（>1000?mg/L）使用时（García-Saucedo等人，2011年；Otero-González等人，2013年）。抗坏血酸可以作为强效抗氧化剂，清除ROS，缓解NPs引起的氧化应激。此外，聚山梨酯80（Tween 80）是一种非离子表面活性剂，可以降低或防止NPs在水介质中的聚集，从而增强其催化活性（Bekhit等人，2020年）。这可以增强Fe?O?纳米颗粒与微生物细胞的相互作用，提高细胞和代谢活性（Bekhit等人，2020年）。尽管聚山梨酯80已在预处理和发酵过程中得到广泛应用（Ribeiro等人，2023年），但尚未有关于在生物乙醇接种剂开发中同时添加聚山梨酯80和抗坏血酸以协同提高Fe?O?纳米颗粒催化活性的报道。将聚山梨酯80和抗坏血酸结合使用，作为一种同时改善纳米颗粒分散性、促进细胞内抗氧化剂传递和减轻氧化应激的策略，在纳米颗粒辅助的接种剂开发和发酵过程中尚未得到系统研究。

优化接种剂开发过程可以提高接种剂的活性和代谢活性。这反过来可以为发酵过程提供一个活跃且可行的起点，有望增加产品产量、缩短发酵时间并提高底物利用效率。迄今为止，关于基于纳米颗粒的接种剂开发（特别是使用S. cerevisiae

传统的优化方法，如响应面方法（RSM），已在不同领域得到广泛应用（Talasila和Vechalapu，2014年），但它们在处理多变量和非线性系统时存在局限性。RSM主要依赖于二次多项式近似，这限制了其在建模高度复杂或非线性生物系统时的有效性。在RSM中，二次近似使用二次多项式方程来关联工艺因素和响应。该方程可以捕捉线性效应、个别效应、相互作用以及因素对响应的曲率（检测最佳响应点），从而最大化或最小化响应。常用的二次近似包括中心复合设计（CCD）和Box-Behnken设计（BBD）。

为了解决RSM的这些局限性，本研究结合了大型语言模型（LLM）来增强实验设计和解释。LLM已经证明了处理和分析复杂数据集（如非线性生物数据集）的能力，揭示模式并提供与上下文相关的见解，成为传统优化方法的补充工具（Liu等人，2024年）。基于上下文的检索增强生成（CD-RAG）的实施提高了LLM生成准确和上下文相关输出的稳健性和可靠性。这种稳健的方法尚未在生物乙醇生物接种剂开发中应用，因为这种方法可以为生物加工接种剂开发提供额外的见解，最终提高生物乙醇产量。

此外，在生物乙醇生物加工中采用了不同的发酵模式。最常见的模式是单独的水解和发酵（SHF）以及同时的糖化和发酵（SSF）（Laltha等人，2021年）。在SHF过程中，首先在糖化酶的最佳温度下对预处理的木质纤维素生物质进行酶促糖化，然后加入适当的微生物进行发酵。在SHF过程中，可以独立优化酶促水解和发酵的温度。因此，本研究中结合了SHF过程和开发的接种剂来提高生物乙醇产量。

因此，本研究的目的是：（1）通过基于纳米颗粒的接种剂开发和大型语言模型辅助的添加剂添加来开发和评估提高生物乙醇产量；（2）确定Fe₃O₄纳米颗粒浓度、温度和暴露时间对开发高活性S. cerevisiae BY4743接种剂的交互效应；（3）评估大型语言模型辅助的添加剂（Tween 80和抗坏血酸）对接种剂开发的影响；（4）使用单独的水解和发酵（SHF）评估优化后的接种剂在生物乙醇生产中的效果。

部分摘录

氧化铁（III）纳米颗粒的合成与表征

氧化铁（III）纳米颗粒（Fe₃O₄ NPs）是通过将1.0?g的FeSO₄.7H₂O溶解在100?mL蒸馏水中制备的。调整pH至12，然后将体积补足至200?mL。溶液在700?W的微波炉中加热10?分钟（相当于80?°C的温度），之后将得到的磁性Fe₃O₄纳米颗粒沉淀物冲洗并在80?°C下干燥（Prochazkova等人，2013年）。所得的干燥Fe₃O₄纳米颗粒经过表征后用于S. cerevisiae BY4743接种剂

制备的氧化铁纳米颗粒（Fe₃O₄ NPs）催化剂的特点

通过TEM观察到的Fe₃O₄纳米颗粒的形态显示，这些颗粒呈粗糙的球形结构，聚集在一起，尺寸分布较窄（18–37?nm），平均尺寸为31?nm。制备方法和所用前体的不同可能导致与其他研究相比直径和尺寸分布的差异（Mohammadyani等人，2012年；Sanusi等人，2019年）。能量色散光谱（EDS）

通过接种剂开发策略生产生物乙醇的经济影响

本研究提出了一种接种剂开发策略，以改进生物乙醇产量，并进行了初步的经济评估（表6，补充表S3和S4），以阐明其可行性。本研究的经济评估基于以下假设：关键直接成本（资本成本、运营成本和公用事业成本）可用于预测盈利能力以及估计的回收时间（EPBT）（van Coller和Marx，2022年）。

结论

本研究优化了基于Fe₃O₄纳米颗粒的S. cerevisiae接种剂开发，以提高生物乙醇产量。总蛋白分析显示，在纳米催化条件下，蛋白质浓度比对照组（964.733?±?36.298?μg/mL）提高了（1057.067?±?25.456?μg/mL），表明代谢活动和生物合成过程得到了增强。

CRediT作者贡献声明

Sinenhlanhla L. Mweli：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。Isaac A. Sanusi：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、监督、方法学、概念化。Lorika S. Beukes：监督、资源管理。Gueguim E.B. Kana：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、概念化。

资助

不适用。

利益冲突声明

作者声明在本研究中不存在任何财务或其他利益冲突。