基于电泳沉积碳纳米管的无试剂适体传感器用于尿样中铜绿假单胞菌床旁检测

《Biosensors and Bioelectronics: X》：Electrophoretically Deposited Carbon Nanotube-Based Reagent-Free Aptasensor for Point of Care Detection of Pseudomonas aeruginosa in Urine Samples

本研究针对铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa )快速检测难题，开发了一种基于电泳沉积羧化多壁碳纳米管(c-MWCNTs)修饰丝网印刷碳电极(SPCEs)的无试剂电化学适体传感器。该传感器通过亚甲蓝(MB)标记的适体特异性识别目标菌，利用方波伏安法(SWV)实现定量检测，在1 × 101至1 × 107CFU/mL范围内呈现良好线性关系，检测限低至1 CFU/mL，并在未稀释尿样中成功验证，为临床和环境样本的快速灵敏检测提供了有力工具。

　　

在临床微生物检测领域，时间就是生命。铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa )作为一种常见的条件致病菌，是医院内感染的主要元凶之一，尤其对免疫缺陷患者、重症监护室(ICU)的儿童和老人构成严重威胁。世界卫生组织(WHO)已将其列为对抗菌药物产生耐药性的"严重威胁"级病原体。传统的细菌检测方法，如平板培养法、生化试验、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术和聚合酶链式反应(PCR)等，虽然特异性高，但普遍存在耗时长、设备昂贵、操作复杂、需要专业人员等局限性，难以满足床旁快速诊断的迫切需求。

在这一背景下，电化学生物传感器因其便携、经济、高灵敏度的优势展现出巨大潜力。其中，适体(aptamer)作为一种通过体外筛选技术获得的人工合成核酸分子，以其高亲和力、易修饰、稳定性好等特点，成为抗体的理想替代品。然而，开发能够直接在丝网印刷碳电极(SPCE)表面探测细菌与电极相互作用、且无需外加试剂的适体传感器仍面临挑战。

为此，研究人员在《Biosensors and Bioelectronics: X》上发表了一项创新研究，他们成功构建了一种基于电泳沉积(EPD)技术修饰羧化多壁碳纳米管(c-MWCNTs)的无试剂电化学适体传感器，用于尿样中铜绿假单胞菌的高灵敏、高选择性检测。

研究团队运用了几项关键技术：首先，采用电泳沉积技术在丝网印刷碳电极(SPCE)表面可控地沉积c-MWCNTs以增强导电性和信号响应；其次，将亚甲蓝(MB) redox label共价标记到氨基修饰的适体上，构建无试剂检测探针；最后，通过EDC-NHS化学法将适体共价固定于c-MWCNTs/SPCE平台，利用方波伏安法(SWV)监测适体与细菌结合前后电信号的变化进行定量分析。用于方法验证的尿路感染(UTI)阳性人尿样源自当地诊断实验室。

3.1. SPCEs/c-MWCNTs的表征

通过扫描电子显微镜(SEM)和拉曼光谱(Raman spectroscopy)对修饰电极进行表征。SEM显示电泳沉积后SPCE表面形成了高密度、管状结构纠缠的c-MWCNTs网络。拉曼光谱显示D带(~1347 cm^-1)和G带(~1576 cm^-1)的强度比(I_D/I_G)为1.30，表明c-MWCNTs存在中等程度缺陷。原子力显微镜(AFM)和场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)图像证实了适体固定及铜绿假单胞菌在电极表面的成功结合。

3.2. SPCEs/c-MWCNTs/Apt适体传感器组装的电化学表征

循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)用于表征电极修饰过程。CV结果显示，与裸SPCE相比，SPCE/c-MWCNTs电极显示出更尖锐、更高的氧化还原峰，证实c-MWCNTs修饰增强了导电性和电荷转移能力。适体固定后，由于适体骨架带负电的磷酸基团排斥溶液中 redox probe，导致氧化还原峰电位发生变化。EIS显示，修饰过程中电荷转移电阻(R_ct)的变化与电极界面性质改变一致。SWV结果表明，SPCEs/c-MWCNTs/Apt平台在MB的特征电位处产生了显著的电信号，而裸SPCE和SPCEs/c-MWCNTs则无此信号，证明了MB-适体成功修饰并具有良好的电化学活性。

3.3. 实验条件的优化

对SWV频率、孵育时间、pH值、温度等参数进行了优化。频率在1-30 Hz范围内信号清晰可辨，30 Hz后响应趋于平稳，故选择30 Hz进行后续实验。pH影响研究表明，峰值电位随pH升高负移，斜率ΔE/ΔpH ≈ -62 mV/pH，接近能斯特方程理论值，pH 7.0时信号最强。孵育时间实验表明，信号随孵育时间增加（至60分钟）而逐渐降低，表明适体与靶标结合限制了电子转移，故选择60分钟为最佳孵育时间。温度实验显示，SWV峰值电流随温度升高（25-50 °C）而降低，与适体在高温下变性一致，表明较低温度更利于保持适体功能。

3.4. SPCEs/c-MWCNTs/Apt适体传感器组装的分析性能

特异性测试显示，该传感器对铜绿假单胞菌及其PAO1菌株具有高选择性，信号抑制率分别达25.24%和29.70%，而对其他测试菌株（如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌等）的信号抑制均低于10%。灵敏度测试表明，传感器在1 × 10¹至 1 × 10⁷CFU/mL浓度范围内呈良好线性关系，检测限(LOD)低至1 CFU/mL。重复性良好，五个独立制备的电极对10⁷CFU/mL的PAO1检测结果一致。在实际尿样检测中，对四个UTI患者尿样进行加标回收实验，回收率在103%-131%之间，相对标准偏差(RSD)均小于7.75%，证明了其在复杂生物基质中的可靠性。

本研究成功开发了一种基于MB标记适体的简单、高灵敏电化学适体传感器，用于铜绿假单胞菌的特异性检测。该传感器利用SWV技术，通过适体与靶标结合引起的MB电信号变化实现定量，具有宽线性范围(10¹-10⁷CFU/mL)和极低的检测限(1 CFU/mL)。研究强调了其在灵敏度、特异性、重复性和稳定性方面的优异表现。通过在未稀释人尿样中的直接检测以及在使用一次性吸收材料（如婴儿尿布和卫生巾）的概念验证实验，证实了该传感器在模拟UTI条件下的应用潜力。这项工作为开发用于临床和环境样本中病原菌快速检测的床旁诊断工具提供了有前景的平台。未来研究将侧重于提高传感器的储存稳定性、操作稳健性，以及评估其在更复杂生物基质中的性能，最终目标是将其集成到便携、用户友好的床旁诊断系统中。