《Brain Research Bulletin》：Dendrobine Attenuates Postoperative Cognitive Dysfunction by Inhibiting Runx1-Mediated NF-κB Signaling Pathway
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本文推荐：为应对老年患者术后认知功能障碍（POCD）这一临床难题，研究人员聚焦神经炎症机制，探讨了石斛碱对Runx1/NF-κB通路的调控作用。研究发现，石斛碱可抑制小胶质细胞M1极化、促进M2极化，降低促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表达，减轻海马神经元凋亡并改善突触可塑性（BDNF、PSD95、SYN1），最终改善认知功能。该研究为靶向Runx1/NF-κB轴防治POCD提供了新策略。
随着全球老龄化进程加速和外科手术技术的普及，接受手术的老年患者数量持续增加。然而，一种名为术后认知功能障碍（POCD）的神经系统并发症，正悄然影响着大量老年患者的术后康复质量与长期生活水平。POCD并非简单的“术后糊涂”，而是一种表现为记忆、注意力、执行功能和视空间能力受损的神经精神综合征。尽管其发病有时隐匿，容易被忽视，但其长期后果却相当严重：患者可能面临住院时间延长、康复延迟、生活自理能力丧失，甚至术后一年内死亡率增加的风险。据统计，术后第一周POCD的发生率高达25%-40%，甚至有10%-15%的患者在术后三个月仍存在持续的认知功能下降。
POCD的发病机制复杂，涉及全身炎症反应、血脑屏障（BBB）破坏、神经炎症、氧化应激、神经递质失衡和神经元凋亡等多个环节的相互作用。手术创伤会引发外周炎症反应，导致促炎细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高。在老年或身体状况欠佳的患者中，血脑屏障通透性常常因内皮功能障碍或年龄相关性退化而增加，使得这些循环中的炎症介质得以渗透进入中枢神经系统（CNS）。这一过程会触发常驻免疫细胞（特别是小胶质细胞）的激活，使其向促炎的M1表型极化。激活的小胶质细胞会释放额外的细胞因子和活性氧（ROS），形成一个自我放大的炎症循环，最终损伤神经元、损害突触可塑性，导致认知功能障碍。
面对POCD防治的临床挑战，寻找能够特异性靶向神经炎症关键环节的药物成为研究热点。石斛碱是一种从传统中药石斛属植物中提取的生物活性生物碱，已被报道具有抗炎、抗氧化和神经保护特性。先前研究表明，石斛碱可通过阻断核转位和下游信号传导来抑制NF-κB（核因子κB）的激活，而NF-κB是调节促炎基因表达的关键转录因子。近年研究还发现，Runx1（runt相关转录因子1）在调节免疫细胞活化和炎症中扮演重要角色。Runx1可能与NF-κB相互作用，增强促炎基因的转录，从而加剧炎症反应。这种RUNX1/NF-κB轴已在LPS（脂多糖）诱导的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和肺部疾病中被证实，但其在POCD中的作用尚不清楚。
为解决这一问题，研究人员开展了一项系统研究，旨在阐明石斛碱缓解POCD的分子和细胞机制。研究成果发表在《Brain Research Bulletin》上，为围术期神经保护策略的开发提供了新的理论依据。
关键技术方法概述
本研究综合运用了动物行为学评估（莫里斯水宫实验、新物体识别实验）、分子生物学技术（Western blotting、免疫荧光染色）、体外细胞模型（BV2小胶质细胞与HT22神经元共培养体系）以及转录组学分析（RNA测序及KEGG富集分析）。通过siRNA敲低、药理学抑制（Ro5-3335）和过表达等技术在BV2细胞中对Runx1的功能进行了验证。实验动物为18月龄老年C57BL/6小鼠，POCD模型通过七氟醚麻醉联合剖腹探查术建立。
研究结果
4.1. 石斛碱改善POCD小鼠的认知缺陷
通过莫里斯水宫实验和新物体识别测试评估石斛碱对认知功能的影响。在MWM测试中，POCD小鼠表现出显著的空间学习障碍，表现为寻找隐藏平台的潜伏期延长和探查试验中平台穿越次数减少。石斛碱治疗显著缩短了逃避潜伏期，并增加了平台穿越次数和在目标象限停留时间，其中高剂量组改善效果更明显。在NOR测试中，POCD小鼠的识别指数降低，表明物体识别记忆受损。石斛碱给药显著提高了识别指数，表明其能改善POCD小鼠的空间记忆和识别记忆。
4.2. 石斛碱减轻海马区小胶质细胞激活和神经炎症
免疫荧光染色显示，与假手术组相比，POCD小鼠海马区Iba1+小胶质细胞增加。POCD增加了Iba1+CD86+（M1型）小胶质细胞的比例，而石斛碱处理减少了Iba1+CD86+细胞，增加了Iba1+CD206+（M2型）细胞，表明小胶质细胞向抗炎表型极化。Western blot分析进一步显示，POCD组TNF-α、IL-1β和IL-6表达升高，石斛碱治疗以剂量依赖方式显著降低了这些细胞因子的表达。
4.3. 石斛碱抑制POCD小鼠海马区细胞凋亡
通过分析凋亡相关蛋白表达评估石斛碱对海马细胞凋亡的调节作用。在POCD小鼠中，促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低。石斛碱以剂量依赖方式逆转了这些变化。
4.4. 石斛碱增强海马区突触可塑性
评估突触可塑性相关蛋白以确定石斛碱对神经元功能的影响。Western blot分析显示，POCD小鼠海马区BDNF、PSD95和SYN1水平降低，表明突触功能障碍。石斛碱治疗以剂量依赖方式上调了这些蛋白的表达。
4.5. 石斛碱抑制LPS和七氟醚诱导的BV2细胞炎症因子产生
为研究石斛碱的体外抗炎效果，用LPS和七氟醚处理BV2小胶质细胞。这种联合处理增加了TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。石斛碱处理降低了这些炎症细胞因子的表达。LPS+七氟醚处理诱导了M1极化，表现为iNOS和CD86表达增加。石斛碱逆转了这一趋势，在蛋白和免疫荧光水平上降低了M1标志物，增加了M2标志物CD206和Arg-1的表达。
4.6. 石斛碱减轻小胶质细胞介导的HT22细胞神经毒性
为研究石斛碱的间接神经保护作用，用BV2小胶质细胞的条件培养基培养HT22细胞。来自LPS+七氟醚处理的小胶质细胞的条件培养基增加了HT22细胞凋亡，表现为Bax和cleaved caspase-3上调，Bcl-2下调，以及更高的Annexin V+/PI+细胞计数。相比之下，来自石斛碱处理的小胶质细胞的条件培养基显著减弱了这些变化。
4.7. KEGG分析确定TNF/NF-κB轴为石斛碱潜在作用通路
RNA测序分析鉴定出POCD小鼠海马区有340个上调基因和44个下调基因。石斛碱处理逆转了许多这些变化，与POCD组相比，有93个基因上调和373个基因下调。KEGG通路分析显示，POCD上调基因富集在TNF信号和NF-κB信号通路中，而石斛碱处理后，下调基因富集在TNF和NF-κB信号通路中，表明石斛碱可能通过抑制TNF/NF-κB通路发挥保护作用。
4.8. Runx1在POCD中上调并被石斛碱抑制
转录因子预测确定Runx1是参与POCD及其被石斛碱逆转的关键调节因子之一。RNA测序数据显示POCD小鼠Runx1表达增加，石斛碱处理后其表达被抑制。Western blot验证了这些发现，显示POCD组Runx1蛋白水平升高，石斛碱处理后下调。
4.9. Runx1敲低或抑制增强石斛碱的抗炎和NF-κB抑制作用
为确定石斛碱是否通过Runx1依赖性机制抑制NF-κB信号，首先用siRNA沉默了BV2小胶质细胞中Runx1的表达。LPS和七氟醚刺激后，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著上调。单独石斛碱处理降低了所有三种细胞因子。在Runx1沉默的细胞中，石斛碱对细胞因子产生的抑制作用进一步增强。Western blot结果显示，单独石斛碱显著抑制了NF-κB信号组分磷酸化，表现为p-p65/total p65和p-IKKβ/total IKKβ比率降低。重要的是，Runx1敲低进一步增强了石斛碱对这些磷酸化比率的抑制作用。
使用Runx1抑制剂Ro5-3335进一步验证，得到了一致的结果。石斛碱和Ro5-3335联合处理降低了TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，并对p-p65和p-IKKβ产生了比单独石斛碱更强的抑制作用，证实了Runx1在POCD相关炎症信号中的作用。
4.10. Runx1过表达消除石斛碱的抗炎作用
为进一步确认Runx1在石斛碱介导的NF-κB抑制中的作用，在BV2小胶质细胞中过表达Runx1并评估下游炎症反应。LPS+七氟醚刺激后，石斛碱处理在正常情况下显著降低了TNF-α、IL-1β和IL-6水平。然而，Runx1过表达显著减弱了石斛碱的抗炎作用，导致其降低细胞因子的效果被逆转。Western blot分析显示，石斛碱诱导的p-p65/p65和p-IKKβ/IKKβ比率降低在Runx1过表达时被削弱。
研究结论与意义
本研究提供了令人信服的证据，表明石斛碱能有效减轻术后认知功能障碍，主要通过抑制海马神经炎症和神经元凋亡实现。行为学和分子分析显示，石斛碱给药显著恢复了因手术和七氟醚麻醉而受损的空间学习和识别记忆。这些认知改善伴随着小胶质细胞激活减少、海马促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达降低以及经典NF-κB信号通路抑制。
从机制上讲，研究数据表明石斛碱通过下调Runx1发挥其抗炎和神经保护作用，Runx1是一种新近被证实与POCD发病机制相关的转录因子。Runx1敲低或药理学抑制增强了石斛碱对NF-κB活化和炎症因子产生的抑制作用，而Runx1过表达则削弱了这些作用，证实了Runx1与活化小胶质细胞中NF-κB的功能联系。
该研究的创新点在于首次在手术模型认知功能障碍中阐明石斛碱的保护作用，并揭示其与特定炎症信号级联的相互作用。更重要的是，确定了Runx1作为POCD背景下NF-κB激活的关键上游介质，为理解POCD发病机制提供了新视角。从转化角度看，发现Runx1/NF-κB轴作为POCD中可药物化靶点具有重要临床意义。石斛碱不仅减轻神经炎症，还能促进突触蛋白表达（BDNF、PSD95、SYN1）并防止海马神经元凋亡，显示出广泛的神经生物学益处。石斛碱与选择性Runx1抑制剂的组合使用可能代表一种协同治疗策略。总体而言，该研究揭示了石斛碱通过Runx1依赖性机制发挥抗炎和认知保护作用的新机制，为开发POCD及相关神经炎症疾病的靶向疗法开辟了新途径。
