《Chemico-Biological Interactions》：ALKBH5-mediated autophagic flux impairment is involved in bilirubin neurotoxicity
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胆红素通过抑制自噬流引发神经毒性，ALKBH5通过调控VMP1、RRAGC和PRKAA1等靶基因影响m6A修饰介导的自噬，为高胆红素血症治疗提供新靶点。
Jinfu Zhou|Sining Liao|Chenran Zhang|Guilin Li|Fuli Zheng|Guangxia Yu|Hong Hu|Wenya Shao|Zhenkun Guo|Siying Wu|Jianping Tang|Huangyuan Li
福建医科大学临床医学院妇产科与儿科福建妇幼保健医院医学遗传诊断与治疗中心，中国福建省福州市350001
摘要
胆红素诱导的脑损伤是高胆红素血症的严重临床后果，然而自噬的作用及其潜在的分子机制仍大部分不为人所知。在这里，我们首次证明N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化酶AlkB同源物5（ALKBH5）介导的自噬通量失调会促进胆红素引起的神经毒性。分别使用过度分化的PC12细胞和新生Sprague-Dawley大鼠作为体外和体内模型。体内实验首先显示高胆红素血症会导致自噬失调和神经元损伤。体外实验进一步观察到胆红素暴露会抑制自噬，这通过p62和LC3-II蛋白表达下调以及透射电子显微镜结果得到证实。此外，我们发现自噬通量受损是由于胆红素暴露后初始阶段的抑制，这一点通过雷帕霉素和巴菲洛霉素A1得到了药理学验证，并且p-mTOR和BCL2蛋白表达上调。更重要的是，我们发现ALKBH5过表达会加剧胆红素诱导的自噬通量损伤，而ALKBH5敲低则可以减轻这种抑制。从机制上讲，通过mRNA稳定性检测、RT-PCR分析和生物信息学分析，确定了液泡膜蛋白1（VMP1）、Ras相关GTP结合蛋白C（RRAGC）和蛋白激酶AMP激活的催化亚基α1（PRKAA1）是ALKBH5影响自噬通量的靶基因，从而促进了胆红素诱导的神经毒性。总体而言，我们的发现表明ALKBH5参与了胆红素诱导的自噬通量受损，并提出m6A依赖的自噬可能是高胆红素血症的潜在治疗靶点。
引言
新生儿高胆红素血症是最常见的临床疾病之一，其特征是胆红素的积累。未结合胆红素（UCB）可以穿过血脑屏障，具有神经毒性并导致脑损伤，称为胆红素性脑病；在更严重的情况下（核黄疸），则会出现不可逆的神经后遗症[1]。然而，UCB神经毒性的分子机制尚未完全明了。
自噬，也称为巨自噬，在通过清除异常蛋白质和细胞器来维持正常神经元功能方面起着关键作用[2]。它包括四个主要步骤：诱导和吞噬体形成、自噬体与溶酶体的融合以及降解和回收。微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）对自噬体膜的形成非常重要。当形成完整的自噬体时，LC3蛋白在ATG4蛋白酶的作用下被切割成LC3B-I。在自噬相关蛋白7（ATG7）和ATG3的存在下，LC3B-I与磷脂酰乙醇胺（PE）结合形成LC3B-II[3]。p62在与LC3B结合后促进自噬体内容的降解[4]。因此，LC3B和Sequestosome（p62）是参与自噬的典型标记蛋白，它们的水平反映了自噬活性。关于自噬在UCB神经毒性中的作用的研究很少。长期胆红素暴露会激活神经元中的自噬，最终导致神经元损伤和凋亡[5]。然而，也有报道称神经元自噬可以保护神经元免受胆红素引起的毒性[6]。因此，自噬与UCB神经毒性之间的相互作用仍不清楚。此外，这种相互作用的具体机制目前尚不明确。
表观遗传修饰，包括miRNA、组蛋白乙酰化和DNA甲基化，调节胆红素引起的神经元损伤[7]、[8]、[9]。N6-甲基腺苷（m6A）甲基化是真核生物中mRNA的主要修饰形式，是一种非常重要的转录后机制。m6A的形成受到甲基转移酶（如METTL3、METTL14和WTAP）和去甲基转移酶（如ALKBH5和FTO）以及读取蛋白（如YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白F1/2）的调控[10]。与自噬相关的基因转录本也受到这种修饰的影响，这已被证明可以调节神经疾病的发病和进展[11]、[12]、[13]。ALKBH5调节细胞自噬，可能是缓解钴诱导的神经退行性损伤的潜在靶点[14]。我们之前的研究表明UCB可以通过下调ALKBH5来调节m6A修饰[15]。然而，ALKBH5是否真的调节自噬以及是否参与UCB诱导的神经元损伤仍不清楚。
在这项研究中，我们旨在揭示ALKBH5介导的自噬在UCB诱导的神经元损伤中的作用，作为胆红素性脑病发病机制的潜在因素。当前的发现可能为有效预防和临床治疗胆红素引起的脑损伤铺平道路。
材料
苯肼盐酸盐（PHZ）、胆红素和3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）试剂盒（17–700）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。巴菲洛霉素A1（HY-100558）和雷帕霉素（HY-10219）购自MCE（中国上海）。AG RNAex Pro试剂（AG21102）、Evo M-MLV RT试剂盒及gDNA清洁剂用于qPCRII，以及SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒（AG117010）购自Accurate Biotechnology（中国湖南省）。
高胆红素血症引起的脑损伤中的自噬功能障碍 体内 模型
先前的研究表明，在Ugt1-/-小鼠模型中，胆红素会在新生儿高胆红素血症期间触发小脑组织中的自噬[5]。我们观察到PHZ诱导的新生儿高胆红素血症期间小脑组织中的自噬变化。HE染色和Nissl染色显示高胆红素血症模型中的神经元损伤显著。
讨论
先前的研究发现，胆红素神经毒性的机制涉及氧化应激[18]、凋亡[19]、内质网应激[20]、铁死亡[15]和神经炎症[22]。在这项研究中，我们发现胆红素可以抑制自噬，从而导致神经元细胞损伤。m6A依赖的自噬可能成为治疗高胆红素血症的潜在临床靶点。我们的研究揭示了胆红素诱导的神经毒性的新表观转录组机制。
结论
我们的研究发现，胆红素处理会导致自噬通量受损，从而引发神经毒性。从机制上讲，我们证明了ALKBH5介导的m6A修饰导致胆红素暴露后的自噬通量受损。我们的发现表明，m6A依赖的自噬可能成为治疗高胆红素血症的潜在临床靶点。
作者贡献声明
Wenya Shao： 方法学、数据分析。Hong Hu： 软件、数据分析。Guangxia Yu： 方法学、研究、数据分析。Fuli Zheng： 验证、资源准备。Guilin Li： 资源准备、方法学。Chenran Zhang： 原稿撰写、研究。Sining Liao： 原稿撰写、数据分析、数据管理。Huangyuan Li： 原稿撰写、审稿与编辑、概念构思。Jinfu Zhou： 原稿撰写、资金获取、概念构思。Jianping Tang： 原稿撰写——
数据和材料的获取
本研究中的数据和材料可应要求向相应作者获取。
伦理批准和参与同意
本研究已获得福建省妇幼保健医院机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号2020KY093；中国福州）。所有操作均谨慎进行，尽量减少大鼠的痛苦。
资助
本研究得到了福建省自然科学基金（资助编号2020J01327、2024J08267）、福建省卫生科技项目（资助编号2024CXA038、2024GA054和2020GGB017）以及福建省科技创新联合基金（资助编号2020Y9143、2023Y9366）和国家疾病控制与预防局2025年公共卫生人才培训计划的支持。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
作者感谢福建医科大学公共技术服务中心的Junjin Lin和Linying Zhou提供的技术支持（中国福州）。
