从Bacillus velezensis GLY4中鉴定出一种新型且具有热稳定性的漆酶，并将其应用于黄曲霉素的生物转化

《Food Bioscience》：Identification of a novel and thermostable laccase from Bacillus velezensis GLY4 and its application in the biotransformation of aflatoxins

高温稳定漆酶LacGLY4从枯草芽孢杆菌B. velezensis GLY4中成功鉴定，在pH8.0和85℃时活性最佳，30分钟内以20μg/mL酶量转化95%的AFB1，并有效降解AFB2、AFM1、AFG1及AFG2。其半衰期在40-60℃时分别为77、63和53分钟，对赭曲霉毒素ZEN有57%活性，但对DON和PAT活性不足10%。产物C24H30O6经LC-MS分析，推测降解机制为复杂加成还原反应而非简单水解。该酶适用于80℃左右、30分钟加工周期的生物脱毒场景，为粮油加工提供新工具。

　　

张鑫|欧阳彬彬|徐伟|孙洪斌|穆婉萌

郑州轻工业大学食品与生物工程学院，中国河南省郑州市科学大道136号，450000

摘要

近年来，基于酶的黄曲霉毒素（AFs）转化方法受到了广泛关注。其中，微生物漆酶的研究最为深入。本研究从Bacillus velezensis GLY4菌株中分离出一种耐热漆酶（命名为LacGLY4）。该重组酶能够在大肠杆菌中顺利表达，并通过Ni²⁺亲和层析法进行纯化。LacGLY4在pH 8.0和85 °C时表现出最佳活性，在75-95 °C范围内对AFB₁的降解效率仍然较高。在优化条件下，20 μg/mL的LacGLY4可在30分钟内将10 μg/mL的AFB₁全部转化。LacGLY4在40、50和60 °C下的半衰期（t_1/2）分别为77分钟、63分钟和53分钟。该酶对多种AFB₁类似物的转化效率分别为0.132 U/mg（AFB₂）、0.077 U/mg（AFM₁）、0.071 U/mg（AFG₁）和0.107 U/mg（AFG₂）。此外，LacGLY4对ZEN的转化效率约为57%，但对DON和PAT的转化效率低于AFB₁的10%。通过液相色谱-串联质谱法鉴定出LacGLY4转化AFB₁的主要产物为C₂₄H₃₀O₆。推测该产物是通过复杂的加成还原反应生成的，而非简单的水解反应。这种细菌漆酶兼具良好的耐热性和高效的转化能力，为生物控制AFB₁污染提供了新的酶工具，尤其是在温度约为80 °C、处理时间约为30分钟的油脂精炼脱胶过程中。

引言

霉菌毒素是由Fusarium、Aspergillus和Penicillium等丝状真菌产生的次级代谢产物。这些有毒化合物在特定环境条件下合成，如高湿度（70%）、25-30 °C的温度以及营养竞争，因此在热带和亚热带地区尤为普遍（El-Sayed等人，2022年）。霉菌毒素具有稳定的物理和化学性质，在烹饪、碾磨或发酵等食品加工过程中不易降解。例如，黄曲霉毒素B₁（AFB₁）能耐受高达268 °C的温度，这使得其解毒变得十分困难。其持久性导致其在食物链中积累，尤其是在玉米、小麦等谷物作物以及乳制品和动物组织中，从而通过长期暴露威胁人类和动物的健康（Mahato等人，2019年）。

霉菌毒素的毒性作用多种多样：AFB₁可导致DNA加合物的形成，进而引发肝细胞癌；赭曲霉毒素A（OTA）会抑制线粒体ATP的产生并促进肾小管坏死；伏马毒素B1（FB1）会干扰鞘脂代谢，与神经管缺陷有关（Alshannaq和Yu，2017年）。根据联合国粮食及农业组织（FAO）的数据，全球每年约有25%的农作物受到霉菌毒素污染，其中撒哈拉以南非洲和东南亚地区的玉米和花生等主粮作物的污染率超过40%。这导致全球每年经济损失接近1000亿美元，包括牲畜死亡、农业贸易减少和医疗负担增加。气候变化加剧了污染风险。据预测，由于温度升高，到2050年欧洲玉米中的黄曲霉毒素污染可能增加50-150%（Battilani等人，2016年）。国际癌症研究机构（IARC）将AFB₁列为1类人类致癌物，单次1 mg/kg的剂量即可对啮齿动物致死。AFM₁是AFB₁的羟基化代谢物，其在牛奶中的存在显示出与AFB₁相当的致癌性，但对婴儿的健康构成显著风险（Min等人，2021年）。

生物降解方法是指微生物及其产生的酶将AFB₁转化为无毒或低毒产品的过程。与物理和化学解毒方法相比，生物降解方法具有安全性、高效性、环保性以及对饲料和食品营养价值及感官品质影响小的优点，被认为是最有前景的AFB₁解毒方法（Ouyang等人，2025年）。酶降解反应具有高度特异性，并且在温和条件下进行。最近，已发现多种具有应用前景的AFB₁降解酶，包括过氧化物还原酶（Adegoke等人，2023年）、ADPP III（Zhang等人，2024年）、AttM（Cheng等人，2023年）、BacC（Afsharmanesh等人，2018年）和漆酶（A.C. Cabral Silva，2021年）。其中，微生物漆酶的研究最为深入。目前，已从Pleurotus属真菌中鉴定出两种AFB₁降解酶：来自Pleurotus eryngii的Ery4（Loi等人，2023年）和来自Pleurotus pulmonarius的lac2（Loi等人，2016年）。此外，还从不同细菌中鉴定出多种AFB₁降解漆酶，包括来自Bacillus vallismortis的fmb-rL103（Bian等人，2022年）、来自Bacillus licheniformis ANSB821的CotA（Guo等人，2020年）、来自Bacillus licheniformis ZOM-1的CotA（Sun等人，2023年）、来自Bacillus swezeyi的Bswlac（Mwabulili等人，2024年）、来自Bacillus subtilis的BsCotA（Wang等人，2019年）、来自Bacillus subtilis ZJ-2019-1的rCotA（Gao等人，2024年）、来自Bacillus amyloliquefaciens的B10（Xiong等人，2022年）、来自Streptomyces thermocarboxydus的StMCO（Qin等人，2021年）以及来自Weizmannia coagulans 36D1的Lac-W（Hao等人，2023年）。其中，CotA、BsCotA、StMCO和Lac-W的降解产物被证实为AFQ₁或epi-AFQ₁，其毒性显著低于AFB₁，显示出在生物控制黄曲霉毒素方面的巨大潜力（Guo等人，2020年）。本研究首次从Bacillus velezensis GLY4菌株中鉴定出一种新型耐热漆酶（简称LacGLY4），并评估了该重组酶的催化性能及其抑制黄曲霉毒素和其他霉菌毒素的能力。

化学试剂和菌株

黄曲霉毒素（AFs，纯度≥98%）及其他霉菌毒素购自中国天津的Heowns Biochemical Technology Co. Ltd.；2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 二铵盐（ABTS，纯度≥98%）购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich Chemical Co.。所有其他化学试剂均为分析级。E. coli DH5α菌株用于目标基因克隆，E. coli BL21(DE3)菌株用于目标基因表达。

来自Bacillus velezensis GLY4的潜在漆酶基因的进化关系分析

Bacillus velezensis是一种能够抑制产生黄曲霉毒素的Aspergillus flavus生长的细菌。许多B.velezensis菌株，如B.velezensi HC6、B.velezensi B2、B.velezensi 906和B.velezensi NWPZ-8也表现出降解AFs的能力（Wu等人，2022年）。这种同时抑制真菌生长和降解毒素的双重作用使B.velezensis成为农业中控制AFs污染的理想候选菌株。

结论与未来展望

本研究成功鉴定并表征了一种新型且高度耐热的细菌漆酶LacGLY4，该酶源自Bacillus velezensis GLY4菌株。在优化条件下，仅使用20 μg/mL的LacGLY4即可在30分钟内将95%的AFB₁转化。LacGLY4还能有效降解多种AFB₁类似物，其特异性转化效率分别为0.132 U/mg（AFB₂）、0.077 U/mg（AFM₁）、0.071 U/mg（AFG₁）和0.107 U/mg（AFG₂）。UPLC-MS分析鉴定出主要降解产物为C₂₄

CRediT作者贡献声明

张鑫：研究工作。 欧阳彬彬：方法学设计。 徐伟：撰写、审稿与编辑。 孙洪斌：指导与资金申请。

未引用参考文献

Cabral Silva和V，2021年；Greeff-Laubscher等人，2019年。

注释

作者声明没有竞争性财务利益。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：U24A20473）和国家自然科学基金（编号：22408125）的支持。

利益冲突声明

?作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：我，徐伟，来自江南大学，是《食品生物科学杂志》的接收编辑。但我保证在提交过程中将严格遵守该杂志的所有规定。如果还有其他作者，他们也声明自己没有已知的竞争性财务利益或可能影响公正性的个人关系。