《Food Microbiology》：Synergistic regulation of microbial metabolism and quality features in liver products using combined ultrasound-pulsed electric field assisted co-fermentation
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协同超声-脉冲电场促进酵母与乳酸菌共发酵改善羊肉肝品质及风味
Jinglin Xu|Xinze Li|Changyu Zhou|Anderson S. Sant'Ana|Daodong Pan|Jinxuan Cao|Hao Zhang|Qiang Xia
食品科学与工程学院，食品科学与技术学院，浙江智能食品物流与加工重点实验室，宁波大学，宁波315211，中国
摘要
生物发酵过程被广泛用于提高肉制品的质量和风味，但共同施加的物理场在发酵过程中如何协同调节微生物代谢的机制尚未得到充分阐明。在本研究中，将酵母和乳酸菌共同接种用于羊肝发酵，并分别施加超声波（US）、脉冲电场（PEF）及其组合（US-PEF），以评估它们对物理化学性质、感官特性和代谢组变化的影响。结果表明，与UFL组相比，US-PEF显著降低了pH值、总挥发性碱性氮和硫代巴比妥酸反应物质分别23.86%、73.30%和53.40%，同时保持了颜色和质地。此外，感知到的异味强度降低了52.12%，整体风味显著改善。微观结构表征显示，US-PEF处理导致微生物细胞表面结构局部损伤，包括细胞质松弛和液泡增多，这与膜通透性和底物利用增强相一致。非靶向代谢组学分析揭示了不同处理之间的代谢谱明显分离，氨基酸和脂质途径存在差异调节。通过增加膜通透性和潜在激活微生物酶，US-PEF加速了蛋白质降解，增加了二肽和风味活性氨基酸的含量，同时降低了不饱和脂肪酸前体的水平，从而抑制了异味化合物的形成。这些发现阐明了物理场辅助发酵的协同调节作用有助于提高畜产品的质量和风味。
引言
由于营养价值高（蛋白质含量高、脂肪含量低，并含有丰富的维生素和矿物质），羊肉在人类饮食中占有重要地位（Ding等人，2024年）。然而，与猪肉和牛肉等更常见的肉类相比，羊肉的市场份额较低，其异味被认为是限制消费的主要因素（Insausti等人，2021年）。作为羊肉副产品的主要成分，羊肝提供了高质量的蛋白质和多种微量营养素，包括铁、锌和维生素A（Liu等人，2022年）。然而，羊肝具有可食用内脏特有的异味，尤其是金属味和鱼腥味（Peng等人，2025a）。此外，羊肝松散的组织结构和较高的内源性酶活性使其在加工和储存过程中容易发生氧化和变质反应，从而影响其风味稳定性和产品质量（Yasmin等人，2022年）。因此，通过改善羊肝的风味和物理化学性质同时保留其营养价值，对于提高畜产品的附加值至关重要。
微生物发酵在提升肉制品的质量和风味方面起着关键作用，是肉类加工领域的重要研究方向。其中，酵母和乳酸菌（LAB）是最常用的功能性微生物（Kumar等人，2017年）。酵母分泌蛋白酶，水解蛋白质并释放肽和游离氨基酸，从而改善风味和质地（Timira等人，2024年）。乳酸菌产生的有机酸可以降低pH值，抑制腐败微生物，并改善肉制品的颜色和质地（Wang等人，2022年）。与单一菌株发酵相比，酵母和乳酸菌的共培养提供了代谢互补性，加速了底物转化，增加了风味化合物的多样性和含量，并提高了物理化学质量（Ma等人，2023年；Suryaningsih等人，2019年）。然而，传统的发酵系统仍面临挑战，如底物利用效率低、对环境压力的耐受性有限以及代谢产物多样性受限，尤其是在处理涉及多阶段代谢反应和复杂风味形成的复杂底物时（Peng等人，2025b）。因此，需要外部干预来进一步激发微生物的代谢潜力，从而克服传统发酵模型的局限性，提高发酵效率和产品质量。
超声波（US）和脉冲电场（PEF）作为代表性的非热物理场技术，近年来在发酵系统中得到了广泛应用，因为它们能够在细胞水平上引起精确的扰动（Liu等人，2024年）。超声波通过瞬态空化产生微射流和剪切应力，增强对流混合和外部质量传递，并能调节双层流体的流动性及膜蛋白构象，促进底物吸收和关键途径的通量（Prempeh等人，2025年）。脉冲电场施加瞬态高压脉冲，诱导细胞膜的可逆电穿孔，从而显著增加底物和代谢物的跨膜运输，加速细胞代谢反应，最终提高发酵效率（Miranda-Mejía等人，2024年；Yousfi等人，2025年）。然而，单一物理场的有效性高度依赖于处理强度；输入不足可能无法引发生理响应，而过度输入则可能导致质量下降，包括脂质氧化加速、颜色稳定性降低和质地变差，最终影响过程的可控性和重复性（Liu等人，2023年；Wang等人，2023年）。通过结合超声波的对流混合和质量传递优势与脉冲电场诱导的跨膜传输增强效果，US-PEF可以在较低能量输入下实现代谢活动和发酵效率的协同提升，同时减少对物理化学质量和风味的不利影响。尽管如此，现有研究主要集中在物理场对单个菌株或单一酶系统的影响上，而探讨复杂底物条件下混合微生物群落整体代谢调节的研究仍然有限。特别是在非靶向代谢组学层面，系统分析物理场扰动对代谢途径的影响及其与物理化学质量和风味形成的关系仍然不足。因此，需要在混合发酵系统中结合代谢组学与质量评估的综合研究，以深入理解机制并推动高价值利用。
本研究旨在探讨US-PEF共发酵对羊肝质量形成的多维度调节作用。通过pH值、总挥发性碱性氮（TVB-N）、脂质氧化、颜色参数和质地参数来表征物理化学特性，并通过电子鼻（E-nose）分析进行感官评价，以评估整体风味特征。在结构层面，使用透射电子显微镜观察发酵菌株的超微结构，特别关注膜通透性的增加、细胞质松弛和局部液泡化现象。分析了这些变化与细胞活性和代谢能力变化之间的关系。非靶向代谢组学用于解析关键代谢物及其前体的变化，并描绘代谢途径的响应。构建了将代谢谱与物理化学指标和风味属性关联的模型，以阐明代谢网络的重新分布如何驱动羊肝质量的变化。
材料与样品制备
羊肝从中国宁波的当地商业屠宰场购买，并在-20°C下储存直至使用。YPD液体培养基和MRS肉汤从青岛海博生物技术有限公司（青岛，中国）购买。甲基红、亚甲蓝和三氯乙酸（分析级）从上海麦克林生化有限公司（上海，中国）购买。2-硫代巴比妥酸从上海源业生物技术有限公司（上海，中国）购买。
酵母菌株Y1和Y2
pH分析
不同的物理场处理显著影响了羊肝样本的pH值。如表1所示，未经处理的羊肝初始pH值为6.13。与酵母和乳酸菌共发酵后，FL1、FL2和FL3组的pH值没有显著变化（p > 0.05）。在共发酵系统中，乳酸菌产生的有机酸部分被酵母代谢，最终产物为乙醇和CO2，这限制了酸的净积累，从而保持了pH值的稳定性
结论
本研究探讨了超声波和脉冲电场与酵母-乳酸菌共发酵结合使用对羊肝物理化学质量和代谢组水平响应的影响。与未经处理的对照组相比，US-PEF辅助的共发酵降低了pH值、TVB-N和TBARS，同时保持了颜色和硬度，改善了质地属性，并抑制了异味特征。超微结构分析显示微生物细胞膜完整性丧失和通透性增加
CRediT作者贡献声明
Changyu Zhou：撰写 – 审稿与编辑、方法学、正式分析。Anderson S. Sant'Ana：验证、软件、资源。Jinglin Xu：撰写 – 初稿、正式分析。Xinze Li：验证、软件、调查。Hao Zhang：撰写 – 审稿与编辑、资金获取、正式分析、概念化。Qiang Xia：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取、正式分析、概念化。Daodong Pan：撰写 – 审稿与编辑、监督，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32472362；32101862）、浙江省自然科学基金（LY24C200001）、国家重点研发计划（2024YFF1106100）、农业部和农业农村部的中国农业研究系统（CARS-42-25）、宁波市公益研究计划项目（2023S075）、CARS-专项基金、浙江省省级高校的基本研究经费（SJLY2024001）的财政支持。
