ArfGAP依赖的Asap-Arf6-PLCβ信号通路通过内质网IP3调节的钙释放调控突触可塑性

《PLOS Genetics》：An ArfGAP-dependent signaling modulates synaptic plasticity via IP3-regulated calcium release from the endoplasmic reticulum

本文揭示了ArfGAP蛋白Asap通过调控小GTP酶Arf6活性，进而影响磷脂酶Cβ（PLCβ）信号通路和肌醇三磷酸（IP3）介导的内质网（ER）钙释放，从而精细调节果蝇神经肌肉接头（NMJ）的突触形态发生、静息钙稳态及神经递质释放概率。该研究为理解小GTP酶与钙信号在突触可塑性中的交叉对话提供了新的分子机制见解。

　　

ArfGAP包含蛋白Asap在神经元中调控突触形态发生

研究首次通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了果蝇Asap基因的功能缺失突变体（Asap^K23和Asap^B52）。与对照组相比，Asap突变体神经肌肉接头（NMJ）的突触小结数量显著减少，但单个小结的面积和最大小结间直径增大。这些形态缺陷可以通过在神经元中特异性表达全长的Asap转基因得到挽救，而肌肉特异性表达则无效，表明Asap在神经元中发挥关键作用。进一步研究发现，Asap突变体中微管相关蛋白Futsch标记的微管环结构百分比降低，提示Asap对于维持突触前微管细胞骨架的稳定性至关重要。

Asap调节神经递质释放和突触小泡释放概率

电生理记录显示，Asap突变体的自发微型兴奋性突触后电位（mEPSP）频率和诱发的兴奋性突触后电位（EPSP）振幅均显著升高，而mEPSP振幅和量子含量（QC）无显著变化。免疫荧光染色发现，Asap突变体NMJ的活性区标记蛋白Bruchpilot（Brp）的斑点数量和密度增加，同时突触后谷氨酸受体GluRIII簇的面积也增大。在低细胞外钙条件下，Asap突变体表现出更低的突触传递失败率，表明其突触小泡释放概率增加。这些功能增益可能源于活性区数量的增加和/或细胞内钙水平的改变。

Asap突变体中突触稳态可塑性保持完整

为了检验Asap缺失是否预先诱导了突触前稳态可塑性（PHP），研究使用了Philanthotoxin-433（PhTx）来急性抑制突触后谷氨酸受体。结果显示，PhTx处理同样能在Asap突变体中诱导出量子含量的增加和Brp信号的积累，其程度与对照组类似，并且突变体的诱发EPSP水平得以维持。这表明Asap突变体本身的PHP机制是完整的，其增强的突触传递并非由预先诱导的PHP所导致，提示可能存在其他机制，如细胞内钙水平的升高。

Asap通过调节内质网钙释放维持突触活动

使用基因编码的钙传感器GCaMP5G/tdTomato进行的活体成像显示，Asap突变体突触的静息钙水平显著升高。使用膜通透性钙螯合剂BAPTA-AM处理可以抑制突变体增强的突触活动。通过遗传学手段干扰IP₃受体（IP₃R）或兰尼碱受体（RyR）的功能，例如在神经元中表达IP₃海绵体（IP₃-sponge）或RyRRNAi，能够有效抑制Asap突变体增高的mEPSP频率和EPSP振幅，并使突触钙水平恢复正常。然而，干扰线粒体钙/H⁺反向转运体Letm1则无此效果。这些结果表明，Asap通过IP₃R和RyR依赖的内质网钙释放途径来调节静息突触钙水平。

Asap抑制PLCβ依赖的钙释放通路

磷脂酶Cβ（PLCβ）是IP₃信号通路的上游关键分子。研究发现，在神经元中敲低Plc21C（果蝇PLCβ同源物）可以抑制Asap突变体升高的突触钙水平、mEPSP频率和EPSP振幅。这表明Asap位于PLCβ的上游，通过抑制PLCβ-IP₃信号通路来负向调控细胞内钙动态和突触功能。

Asap通过衰减Arf6依赖的信号通路调控突触前形态发生

Asap蛋白包含一个保守的ArfGAP结构域，可负向调节小GTP酶Arf的活性。研究发现，在Asap突变体神经元中表达显性负效的Arf6（Arf6^DN）或敲低Arf6，可以挽救突变体的突触形态缺陷、Brp密度异常和微管环结构减少。相反，在野生型神经元中表达组成型激活的Arf6（Arf6^CA）则能模拟Asap突变体的表型。这些结果证明，Asap通过其ArfGAP活性抑制Arf6的信号传导，从而维持正常的突触结构。

组成型激活的Arf6模拟Asap突变表型并以Rab3依赖的方式改变活性区组织

表达Arf6^CA导致Brp斑点数量增加但强度降低，表明形成了更多但不成熟的活性区。在rab3突变背景下，Arf6^CA无法诱导Brp斑点的增加，且Arf6活性改变对Rab3蛋白水平的影响也依赖于Rab3的功能。这表明Arf6通过Rab3来调节活性区组件如Brp的分布，Rab3是Arf6下游调控活性区组织的关键因子。

Asap通过Arf6调控静息突触钙水平并维持突触活动

钙成像显示，在Asap突变体神经元中敲低Arf6或表达Arf6^DN，可以使升高的突触钙水平恢复正常。功能上，这些操作也能挽救Asap突变体在低钙条件下的低失败率以及增高的mEPSP频率和EPSP振幅。这强有力地表明，Asap是通过Arf6依赖的钙释放途径来调控突触功能的。

Arf6诱导的突触过度生长和活动需要PLCβ-IP₃-RyR依赖的钙信号

上位性分析表明，当在神经元中共表达Arf6^CA并同时干扰PLCβ、IP₃R或RyR的功能时，Arf6^CA引起的突触形态异常（如增大的小结面积）和功能增益（如增高的EPSP振幅）被显著抑制。同时使用IP₃海绵体和兰尼碱受体抑制剂dantrolene处理也能有效逆转Arf6^CA的表型。这直接证明了Arf6是通过PLCβ-IP₃-RyR信号轴来调节钙释放，进而影响突触的结构和功能可塑性。

讨论

本研究阐明了Asap-Arf6-PLCβ-IP₃/RyR信号通路在调控果蝇NMJ突触可塑性中的核心作用。Asap作为Arf6的负调控因子，通过限制PLCβ活性来抑制内质网的钙释放，从而维持正常的静息钙水平、微管稳定性和活性区组织。一旦Asap功能缺失，将导致Arf6-GTP积累，过度激活下游钙释放通路，引起突触钙稳态失衡，最终表现为突触形态异常和神经传递功能增强。该研究首次在体揭示了ArfGAP依赖的信号通路在连接小GTP酶与突触钙信号、协调结构可塑性与功能可塑性方面的重要机制，为理解相关神经系统疾病的病理生理提供了新的思路。