《PLOS Computational Biology》：Persistence diagrams as morphological signatures of cells: A method to measure and compare cells within a population
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本文提出了一种利用拓扑数据分析（TDA）与持久同调（PH）的新颖计算框架，用于量化与比较荧光显微镜下的单细胞形态。该方法将细胞轮廓与细胞核位置结合，通过径向距离函数构建滤波并生成持久图，进而利用2-Wasserstein距离（PH距离）量化细胞间形态差异。研究在人间充质干细胞（hMSC）与HeLa细胞两种实验体系中验证了该方法的有效性，证明其在识别细胞亚群、检测异常形态及量化群体异质性方面优于传统的轮廓比对方法（如长宽比、傅里叶描述子与弹性形状分析）。该框架为传统几何或图像描述子难以处理的细胞形态分析提供了原理清晰、灵敏度高的解决方案。
细胞形态是理解细胞调控、命运与异质性的核心，然而传统基于图像的分析方法在处理多样或不规则形状时往往力不从心。本研究引入了一种基于拓扑数据分析（TDA）的计算框架，旨在从荧光显微镜图像中表征与比较单细胞形态。每个细胞由其轮廓及细胞核位置共同表示，通过基于径向距离函数的滤波构建，生成编码形状拓扑演化的持久图（Persistence Diagram）。两个细胞之间的相似性通过其持久图之间的2-Wasserstein距离来量化，该距离被定义为PH距离。
在理论部分，文章详细阐述了如何将持久同调应用于细胞轮廓分析。通过将细胞边界表示为有序顶点图，并利用从细胞核中心出发的径向距离函数定义子层集，进而追踪连通分量的生灭过程，构建维度0的持久图。特别地，针对闭合轮廓包含单个连通分量与单个1-环的特性，作者创新性地将维度0的 essential 连通分量的出生与维度1的 essential 1-环的出生进行配对，形成修正后的持久图，以更高效地捕获轮廓的拓扑信息。细胞间的比较则通过计算其持久图之间的2-Wasserstein距离实现。
材料与方法部分描述了实验数据的获取与处理流程。研究使用了人间充质干细胞（hMSC）和HeLa细胞两种代表性系统。hMSC为原代细胞，具有固有的异质性；HeLa细胞为永生化细胞系，形态相对均一但存在连续变异。细胞经固定、免疫荧光染色（肌动蛋白用Phalloidin-Atto 550，细胞核用Hoechst染料）后，通过荧光显微镜成像。细胞轮廓使用FilamentSensor2.0工具从肌动蛋白图像中提取，细胞核中心通过Fiji软件使用Otsu阈值分割法确定。所有像素测量值均根据显微镜校准转换为物理单位（微米）。
在轮廓分析环节，提取的轮廓被转换为图结构，并进行清理以去除共线顶点，提高计算效率。随后为每个细胞构建其持久图，并计算所有细胞对之间的PH距离矩阵。基于此距离矩阵，采用聚合层次聚类分析（HCA）并比较了平均连接、完全连接、单连接和Ward连接四种连接方案的效果。为了评估不同连接方案下聚类结果的一致性，文章定义了一种纯度评分（Purity Score）来衡量聚类在不同连接树中的识别程度。
研究结果部分首先展示了PH方法在识别细胞群体内异质性的能力。对hMSC细胞集（X1）的分析发现了一个明显的形态异常细胞（X1-015），其具有细长形状与多个长丝状伪足，与其他细胞差异显著。去除该异常值后，HCA聚类识别出四个亚群（A, B, C, D），其形态特征与文献中报道的hMSC亚群（如快速自我更新小细胞、纺锤形细胞、大而扁平细胞）相符。不同连接方案下，某些亚群（如簇D）显示出高纯度评分，表明其形态一致性。相比之下，对HeLa细胞集（Y1）的分析未发现明确的异常值，且不同连接方案下的聚类结果一致性较差，纯度评分波动较大，反映了HeLa细胞形态的连续变异性，符合其作为永生化细胞系的预期。
为了评估PH距离的性能，研究构建了混合数据集（X1Y1，包含hMSC和HeLa细胞）。多维尺度分析（MDS）显示，PH距离能有效区分hMSC与HeLa细胞，并且能基本恢复hMSC内部的亚群结构。接收者操作特征（ROC）分析进一步量化了PH距离在区分已知细胞类型（Level 1: hMSC vs. HeLa; Level 2: hMSC亚群、异常值及HeLa）方面的效能，其曲线下面积（AUC）和部分AUC（pAUC10）均优于对比方法（长宽比距离、弹性形状距离、傅里叶描述子距离）。特别是在高灵敏度区域（低假阳性率），PH距离表现突出。
研究还将PH方法与三种现有的细胞轮廓距离测量方法进行了比较。长宽比距离仅捕获全局几何特征，性能较差。弹性形状距离表现中等，能区分细胞类型但难以分辨亚群。傅里叶描述子距离（M=10和M=50）性能接近PH距离，但在高灵敏度区域仍不及PH。此外，文章还评估了PH方法对细胞核中心位置扰动的敏感性，结果表明在高达15像素的扰动下，其分类性能（AUC）仍保持稳定，证明了该方法的鲁棒性。
文章最后总结了PH方法在自动化分析细胞形态、识别异常细胞和亚群方面的优势，并指出了未来的研究方向，包括整合更多形态计量学参数、实现端到端的自动化流程以及将方法扩展到三维细胞形态分析。该研究为细胞生物学中形态学量化分析提供了新的强大工具。
