磷脂酸磷酸酶Pap2g通过介导F-actin重排参与调控黑腹果蝇先天免疫

　　

摘要： 【目的】先天免疫系统是黑腹果蝇Drosophila melanogaster抵御病原体入侵的核心防御机制，其中细胞免疫主要由黑腹果蝇血细胞介导。本研究旨在阐明2G型磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid phosphatase type 2G，Pap2g)在黑腹果蝇巨噬细胞吞噬作用中的分子机制，为探究其在黑腹果蝇先天免疫中的功能提供理论依据。【方法】基于转录组测序数据，筛选黑腹果蝇巨噬样Schneider 2细胞系在吞噬凋亡细胞(apoptotic cells, ACs)时上调的基因，筛选出目的基因pap2g；采用RT-qPCR检测在Schneider 2细胞中加入1×10⁷ ACs、 1×10⁵ CFU金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、 1×10⁵ CFU铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa后pap2g的mRNA水平的变化；采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术沉默pap2g后，检测其对感染金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的黑腹果蝇寿命的影响；RT-qPCR检测pap2g的表达被抑制后黑腹果蝇成虫体内免疫信号通路相关基因NFkB, CecA1, Def和Drs mRNA水平变化；使用激光共聚焦显微镜(laser confocal microscopy)观察pap2g RNAi后Schneider 2细胞对ACs及金黄色葡萄球菌的吞噬率变化；用激光共聚焦显微镜观察pap2g RNAi后黑腹果蝇3龄幼虫巨噬细胞丝状伪足形态的变化；用酵母双杂交系统及Western blotting验证Pap2g及细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42, Cdc42)间的相互作用；并用Western blotting验证pap2g RNAi对Cdc42表达量的影响及cdc42 RNAi后Pap2g蛋白表达量的变化。【结果】黑腹果蝇Schneider 2细胞中的pap2g在吞噬作用时呈上调表达趋势；RNAi沉默pap2g导致感染病原菌的黑腹果蝇寿命缩短，且成虫体内免疫信号通路相关基因NFkB, CecA1, Def和Drs表达下调； RNAi沉默pap2g导致Schneider 2细胞对ACs及金黄色葡萄球菌的吞噬率分别减少至41.20%±2.31%及38.90%±3.65%； RNAi沉默pap2g使黑腹果蝇3龄幼虫巨噬细胞丝状伪足数量由(15±1)个减少至(8±1)个，伪足长度由(2.900±0.458) μm缩短至(0.667±0.153) μm； Pap2g蛋白与Cdc42相互作用，且RNAi沉默Schneider 2细胞中pap2g后Cdc42蛋白表达量减少，同样RNAi沉默Schneider 2细胞中cdc42后Pap2g蛋白表达量也随之降低。【结论】Pap2g在黑腹果蝇的先天免疫中具有重要作用，尤其在吞噬过程期间，其表达显著上调； Pap2g与Cdc42相互作用，以调节丝状肌动蛋白(filamentous actin, F-actin)的动态变化，从而影响细胞伪足数目与长度； pap2g的下调导致黑腹果蝇巨噬细胞吞噬能力受损，这凸显了其在宿主防御机制中的重要性。