《Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology》：A potential antioxidant role for melatonin and AFMK in plasma, ovarian fluid, and eggs during reproduction in rainbow trout
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褪黑素（Mel）在 rainbow trout 排卵后卵子抗氧化中起关键作用，通过直接清除自由基生成 AFMK，而非通过酶活性（SOD/CAT/GST）调节。卵黄液 Mel 浓度约为血浆的3倍，且随年龄增长下降，提示卵细胞可能存在局部合成。
康拉德·波米亚诺夫斯基（Konrad Pomianowski）|玛格达莱娜·戈兹多夫斯卡（Magdalena Gozdowska）|斯特凡·多博什（Stefan Dobosz）|拉法尔·罗津斯基（Rafa? Ró?yński）|埃娃·库尔奇科夫斯卡（Ewa Kulczykowska）
波兰科学院海洋学研究所遗传学与海洋生物技术系，波兰索波特市Powstańców Warszawy 55号，邮编81-712
摘要
褪黑素（Mel；N-乙酰-5-甲氧基色胺）在鱼类中被认为既是生物钟的调节剂，也是许多生理过程的调节因子，包括繁殖过程。除了其内分泌功能外，褪黑素还作为一种抗氧化剂发挥作用，它可以直接清除活性自由基并形成N1-乙酰-N2-甲酰-5-甲氧基奎宁胺（AFMK），或者通过影响抗氧化酶的活性来发挥作用。本研究探讨了褪黑素是否有助于保护养殖虹鳟鱼排卵后的卵细胞免受氧化应激的损害。研究人员测量了血浆、卵巢液和卵细胞中的褪黑素及AFMK水平，并检测了卵细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的活性。结果显示，排卵前、排卵时及排卵后的血浆褪黑素浓度没有显著差异，且与卵巢液中的褪黑素浓度无关。AFMK在血浆和卵巢液中均无法检测到，而在卵细胞中两者均存在且呈正相关。这表明褪黑素在卵细胞内直接与活性氧反应，从而生成AFMK。卵细胞中的褪黑素浓度与SOD、CAT或GST的活性无关，说明褪黑素主要通过非酶促方式清除自由基来发挥抗氧化防御作用。与三年龄的雌鱼相比，四年龄雌鱼的卵细胞中褪黑素和AFMK浓度较低，而SOD活性则呈现相反的趋势，这可能表明机体为应对褪黑素水平下降而增强了酶促防御机制。卵细胞中的褪黑素浓度约为血浆或卵巢液中的三倍，这提示褪黑素可能在卵细胞内局部合成。
引言
褪黑素（Mel；N-乙酰-5-甲氧基色胺）是一种吲哚胺类激素，最初于20世纪50年代末被发现，因其能导致青蛙皮肤变白（Lerner等人，1958年），从而揭示了其在脊椎动物色素沉着中的作用。随后，人们发现褪黑素是中枢昼夜节律信号分子，负责将时间信息从大脑传递到外周组织。20世纪90年代初对虹鳟鱼松果体的研究表明，鲑科鱼类能够根据光照和水温变化调节褪黑素的分泌（Max和Menaker，1992年）。近几十年来，褪黑素被证实具有多种代谢和生理功能，包括在鱼类繁殖中的作用（Falcón和Munoz-Cueto，2024年）。此外，褪黑素因其强大的抗氧化特性而受到越来越多的关注。实验证明，褪黑素及其代谢物N1-乙酰-N2-甲酰-5-甲氧基奎宁胺（AFMK）是高效的抗氧化剂和自由基清除剂，可减轻多种生物体的氧化损伤（Galano等人，2013年；Galano和Reiter，2018年；Tan等人，2007年）。这种抗氧化能力被认为是褪黑素最保守的进化特征之一，可能起源于早期生命形式，包括原核生物（Zhao等人，2019年）。然而，关于褪黑素在脊椎动物中的保护作用范围和具体机制仍存在不确定性（Boutin等人，2024年）。我们之前的研究探讨了褪黑素在鱼类氧化应激反应中的作用，发现褪黑素浓度升高可能是鱼类皮肤对氧化应激的适应性反应（Gozdowska等人，2022年；Pomianowski等人，2023年）。本研究旨在探讨褪黑素是否有助于保护养殖虹鳟鱼排卵后的卵细胞免受氧化应激的损害。
鱼卵的质量决定了繁殖成功率。虹鳟鱼等鲑科鱼类特别值得关注，因为它们可以将排卵后的卵细胞保留在体腔内数天甚至数周（Springate等人，1984年）。它们的卵巢缺乏卵腔结构（Romer，1970年），因此排卵后的卵细胞直接释放到体腔中，周围被一种称为体腔液（CF）或卵巢液（OV）的液体包围。这种液体由卵巢上皮分泌，来源于血浆（Coffman等人，2000年；Hirano等人，1978年），含有多种具有特定生物功能的成分，这些成分会影响卵细胞的质量和受精成功率（Gueho等人，2024年；Johnson等人，2014年；Lahnsteiner，2002年）。然而，由于过度成熟过程（也称为排卵后老化，POA），卵细胞质量可能会下降，即排卵后卵细胞的存活能力逐渐丧失（Aegerter和Jalabert，2004年；Rime等人，2004年）。在虹鳟鱼中，保留在体腔内的排卵后卵细胞的受精能力会随时间减弱：某些雌鱼的卵细胞可存活长达三周，而另一些卵细胞的卵细胞质量在两周内显著下降（Aegerter和Jalabert，2004年）。在哺乳动物中，主要由线粒体代谢产生的活性氧（ROS）是卵细胞老化的关键因素（Goud等人，2008年；Lord和Aitken，2013年；Takahashi等人，2013年；Wang等人，2021年）。氧化应激会引发一系列分子事件，导致卵细胞功能下降，包括成熟促进因子（MPF）活性下降、钙稳态紊乱、线粒体功能障碍以及脂质、蛋白质和DNA等关键细胞内靶标的氧化损伤（Lord和Aitken，2013年）。然而，据作者所知，鱼类中的相关证据尚缺乏。为了缓解氧化应激，生物体依赖于由酶促和非酶促成分组成的复杂抗氧化防御系统（Jomova等人，2024年）。Lord等人（2013年）的研究表明，在体外培养基中添加褪黑素可以保护哺乳动物卵细胞免受排卵后老化的影响。褪黑素处理可以延缓细胞凋亡，减少卵细胞碎片化，延长受精窗口期，并提高胚胎质量。这些有益效果归因于氧化应激的减轻，因为经过褪黑素处理的老化卵细胞中的ROS水平显著降低（Lord等人，2013年）。目前尚不清楚鱼类卵细胞中是否存在类似的防御机制。褪黑素的抗氧化作用机制也不完全清楚，可能涉及直接清除自由基及其代谢物AFMK的形成，或间接上调关键抗氧化酶（如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的活性（Rodriguez等人，2004年；Tan等人，2007年；Zhang和Zhang，2014年）。因此，本研究旨在探讨褪黑素的两种潜在作用方式：直接清除自由基和间接调节关键抗氧化酶。
目前广泛认为褪黑素在卵巢中积累，但尚无直接证据表明鱼卵能够合成褪黑素，尽管在眼期胚胎中始终能检测到褪黑素的存在（Yamada等人，2002年）。最合理的来源是母体转移，但不能排除卵黄内的内源性合成，因为已在鸟类卵中发现了褪黑素及其合成酶（Olszańska等人，2007年；Olszańska和St?pińska，2008年）。这些发现提示鱼类卵黄可能具有褪黑素合成能力，值得进一步研究。多项研究表明，在鱼类胚胎发生的早期阶段就存在褪黑素及其合成酶，表明褪黑素的合成始于胚胎发育阶段（Kazimi和Cahill，1999年）。通常认为，褪黑素在早期发育过程中的主要作用是与自由基保护相关，而其激素功能则出现在后期发育阶段（Kalamarz等人，2009年；Maitra和Hasan，2016年）。尽管褪黑素在促进细胞增殖、加速胚胎发育和支持幼体及后期成熟方面的作用已得到证实（Danilova等人，2004年），但我们对其在鱼卵中的来源、存在形式和具体功能的了解仍有限。
本研究旨在探讨褪黑素是否有助于保护养殖虹鳟鱼排卵后的卵细胞免受氧化应激的损害。我们分析了：（1）排卵前14天、排卵时以及排卵后12天的血浆褪黑素和AFMK浓度；（2）排卵后收集的卵细胞和卵巢液中的褪黑素及AFMK水平；（3）排卵后卵细胞中褪黑素和AFMK浓度与关键抗氧化酶SOD、CAT和GST活性的关系。这些分析旨在明确褪黑素的抗氧化作用是否涉及直接清除自由基并生成AFMK，或/和间接调节酶促抗氧化防御机制。
材料与方法
两项实验均在波兰鲁特基（Rutki）的内陆渔业研究所（IFI）鲑科鱼类研究部门的繁殖设施中进行，使用的是同一种春季产卵的虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss，Rutki选育品种）亲鱼。该部门通过完整的繁殖周期维护鲑科鱼类种群，并配备了孵化场、饲养室和混凝土池塘。Radunia河提供的水流速为450 L/s?1。成年亲鱼在
血浆和卵巢液中的褪黑素及AFMK浓度
表1显示了四年龄雌性虹鳟鱼在三个时间点的血浆褪黑素浓度：预计排卵前14天、排卵时（排卵后2-4天）以及排卵后12天。这三个繁殖阶段的褪黑素浓度没有显著差异（P = 0.34，表1）。血浆褪黑素水平与排卵后收集的卵巢液中的褪黑素水平无关（r = 0.45）。AFMK在讨论
近期研究表明，褪黑素参与了两种鱼类（三刺刺鱼和欧洲比目鱼）皮肤的氧化应激反应（Gozdowska等人，2022年；Kulczykowska，2019年；Kulczykowska等人，2018年；Pomianowski等人，2023年）。基于这些发现，本研究探讨了褪黑素是否有助于保护养殖虹鳟鱼排卵后的卵细胞免受氧化应激的损害。
在我们的虹鳟鱼研究中，检测到了褪黑素的存在
结论
综合这些发现，表明褪黑素在卵细胞内直接与活性氧反应，生成AFMK。卵细胞中的褪黑素浓度与抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的活性无关，说明褪黑素主要通过直接中和自由基来发挥抗氧化防御作用，而不是通过增强酶活性。
作者贡献声明
康拉德·波米亚诺夫斯基（Konrad Pomianowski）：撰写初稿、可视化处理、验证、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。玛格达莱娜·戈兹多夫斯卡（Magdalena Gozdowska）：验证、方法学设计、实验实施、数据分析。斯特凡·多博什（Stefan Dobosz）：监督工作、方法学设计、概念构建。拉法尔·罗津斯基（Rafa? Ró?yński）：方法学设计、实验实施。埃娃·库尔奇科夫斯卡（Ewa Kulczykowska）：撰写与编辑、撰写初稿、监督工作、实验实施。
伦理声明
所有实验均符合欧盟委员会2010/63/EU关于动物实验的指令，以及波兰比德戈什茨克科技大学的动物实验伦理委员会制定的指南和批准要求；实验方案编号为16/2024。
资助
本研究由波兰国家科学中心（NCN）资助，资助项目为MINIATURA 8计划，项目编号为2024/08/X/NZ9/00567，资助对象为康拉德·波米亚诺夫斯基（Konrad Pomianowski）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢Magdalena Pabian和Wioletta D?browska（波兰科学院）在实验过程中提供的技术支持，以及Katarzyna Kolanko绘制图形摘要中使用的虹鳟鱼示意图。
