《ACS Chemical Neuroscience》：Elucidation of Molecular Mechanisms of Lipid-Altered Cytotoxicity of TDP-43 Fibrils
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本综述系统阐述了TDP-43 C端结构域（CTD）在脂质双分子层作用下的聚集动力学、纤维形态及其细胞毒性机制。研究发现阴离子脂质（PS、CL）显著加速TDP-43 CTD聚集，并通过改变纤维与细胞器（如线粒体、内质网）的相互作用，调控未折叠蛋白反应（UPR）和自噬通路（LC3b、p62），为ALS、FTD等神经退行性疾病的脂质代谢干预提供了新视角。
引言
TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的进行性聚集是肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）、阿尔茨海默病（AD）及边缘主导的年龄相关TDP-43脑病（LATE）等多种神经退行性疾病的典型病理特征。TDP-43是一种高度保守的核RNA/DNA结合蛋白，参与RNA加工的调控。其C端结构域（CTD）富含甘氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，这些残基促进了TDP-43在脑中形成淀粉样寡聚体和纤维。本研究旨在探讨脂质双分子层对TDP-43 CTD聚集特性及其细胞毒性的影响。
方法
蛋白质表达与纯化：通过大肠杆菌BL21（DE3）表达系统制备6xHis标记的TDP-43279–360CTD片段，利用镍柱亲和层析纯化，并通过透析去除尿素。
脂质体制备：采用薄膜水化法制备由磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰丝氨酸（PS）和心磷脂（CL）组成的大型单层脂质体（LUVs），并通过动态光散射确认其粒径为100 ± 10纳米。
蛋白质聚集动力学：使用硫黄素T（ThT）荧光法监测10微摩尔CTD TDP-43在37°C下48小时的聚集过程，比较脂质存在与否对聚集速率的影响。
形态与结构分析：通过原子力显微镜（AFM）观察纤维形貌，利用原子力显微镜-红外光谱（AFM-IR）分析纤维的二级结构。
细胞毒性评估：以大鼠多巴胺能神经元（N27细胞）为模型，通过JC-1测定线粒体膜电位、ROS检测活性氧水平、qPCR分析未折叠蛋白反应（UPR）相关基因（PERK、ATF6、XBP1）及自噬标记物（LC3b、p62）的表达变化。
结果与讨论
脂质加速TDP-43 CTD聚集：ThT动力学数据显示，阴离子脂质PS和CL显著缩短聚集延滞期（tlag），分别降至32分钟和39分钟，而zwitterionic PC的延滞期与无脂条件相近。这表明阴离子脂质通过静电作用与CTD中的正电荷残基相互作用，促进成核和纤维生长。
脂质改变纤维形态但不影响二级结构：AFM显示无脂条件下形成的TDP-43纤维高度为5-12纳米，呈现扭曲形态；而脂质存在时纤维高度略减（4-9纳米）且表面扭曲消失。AFM-IR谱图表明所有纤维均含约35%平行β折叠、45%无规则卷曲和20%反平行β折叠，脂质未改变二级结构组成。值得注意的是，TDP-43:PC纤维的红外光谱在1730厘米–1处出现PC的C=O振动峰，提示PC被整合入纤维结构。
脂质调控纤维的细胞毒性：流式细胞术和荧光显微镜分析表明，TDP-43纤维均能诱导神经元ROS升高，但线粒体毒性因脂质而异——TDP-43:PC和TDP-43:CL纤维的线粒体去极化程度显著低于无脂纤维，而TDP-43:PS的毒性与之相近。这表明脂质通过改变纤维与线粒体的相互作用特异性调控细胞器损伤。
内体损伤与自噬通路异常：转染Chmp1b（内体修复标记）和Gal3（自噬启动标记）的神经元在接触TDP-43纤维后，两者表达均上调，提示纤维通过内吞作用破坏内体膜结构，导致胞质内β-半乳糖苷泄漏并触发自噬。然而，脂质的存在未显著改变内体损伤程度。
UPR与自噬的转录调控：qPCR结果显示，无脂TDP-43纤维优先激活XBP1通路，而TDP-43:PC和TDP-43:PS纤维强烈上调PERK表达；TDP-43:CL则同步激活PERK、ATF6和XBP1。同时，TDP-43:PC纤维显著升高LC3b和p62转录水平，TDP-43:CL仅上调p62，TDP-43:PS抑制LC3b。这些发现说明脂质通过重塑UPR和自噬相关基因的表达模式，间接影响TDP-43纤维的毒性机制。
结论
脂质双分子层（尤其是阴离子脂质）可加速TDP-43 CTD的淀粉样聚集，并通过整合入纤维结构改变其形态与细胞器特异性毒性。脂质依赖性的UPR通路激活和自噬失调是TDP-43纤维引发神经毒性的关键分子事件。本研究揭示了神经元脂质谱异常与TDP-43病理聚集间的关联，为靶向脂质代谢治疗TDP-43蛋白病提供了理论依据。
