多聚腺苷酸序列与遗传元件对iCre表达及小鼠类冬眠状态诱导的调控作用

《Journal of Comparative Physiology B》：Influence of poly(A) sequences and genetic elements on iCre expression and induction of a hibernation-like state in mice

本研究针对神经元基因敲入模型中多聚腺苷酸[poly(A)]序列选择对基因表达特异性及生理表型影响不明的问题，系统比较了三种Qrfp-iCre等位基因修饰策略。结果表明，SV40 poly(A)可维持Q神经元特异性表达并诱导深度低代谢状态（QIH），而bGH poly(A)破坏特异性，双顺反子设计表达较弱，删除poly(A)虽可部分恢复QIH深度但缩短持续时间。该研究为神经遗传工具设计提供了关键实验依据。

　　

在生命科学领域，精准调控特定神经元群体的活动是解析神经环路功能的关键。近年来，化学遗传学技术的出现使得研究人员能够通过表达设计受体（如DREADD）来远程操控神经元活动。然而，这一策略的成功高度依赖于转基因工具（如iCre重组酶）在目标神经元中的特异性表达。以往研究多聚焦于启动子选择，而位于基因3'末端的多聚腺苷酸[poly(A)]序列作为转录终止和mRNA稳定的关键调控元件，其选择对表达特异性的影响常被忽视。

下丘脑中产生QRFP（Pyroglutamylated RFamide peptide）的神经元（简称Q神经元）被证实是调控能量代谢的重要枢纽。激活这类神经元可诱导小鼠进入一种类似冬眠的低代谢状态，称为Q神经元诱导的低代谢（QIH）。为建立可靠的QIH诱导模型，日本理化学研究所（RIKEN）的研究团队此前构建了QC小鼠品系，通过在Qrfp基因位点敲入iCre序列并连接SV40 poly(A)序列，实现了iCre在Q神经元中的特异性表达。但一个悬而未决的问题是：改变iCre下游的poly(A)序列或其他遗传结构，能否进一步提升表达特异性或增强QIH表型？

为回答这一问题，研究团队在《Journal of Comparative Physiology B》上发表了题为“Influence of poly(A) sequences and genetic elements on iCre expression and induction of a hibernation-like state in mice”的研究论文。他们系统比较了三种不同的遗传修饰策略：将SV40 poly(A)替换为牛生长激素（bGH）poly(A)；引入双顺反子表达系统（T2A或IRES）；以及直接删除poly(A)序列以迫使iCre利用内源性Qrfppoly(A)信号。通过对各品系小鼠的iCre表达模式及QIH表型进行定量分析，研究人员深入揭示了poly(A)序列选择在神经遗传工具设计中的关键作用。

研究主要依赖于几种关键技术方法。通过CRISPR/Cas9介导的基因敲入技术构建了五种不同的Qrfp-iCre小鼠品系（QC、QB、QT、QI、QD）。利用腺相关病毒（AAV）载体将hM3D(Gq)受体特异性递送至Q神经元。通过腹腔注射CNO（Clozapine N-oxide）化学遗传学激活Q神经元。采用间接测热法连续监测小鼠的耗氧量（VO₂）和二氧化碳产量（VCO₂），并基于双指数衰减模型对QIH动力学进行分层贝叶斯建模。通过组织化学染色和荧光成像评估iCre（tdTomato报告基因）和hM3Dq（mCherry标记）的表达特异性。

Changing the poly(A) cassette from SV40 to bGH disrupts iCre specificity and reduces QIH Depth

研究人员首先比较了SV40 poly(A)（QC品系）与bGH poly(A)（QB品系）的效果。与QC小鼠中高度特异性的tdTomato表达相比，QB小鼠表现出广泛且非特异性的表达模式。在QIH表型上，QC小鼠能诱导深度低代谢（|y_min| = [2.86, 3.39] mL O₂·g^?1·h^?1），而QB小鼠的QIH深度显著减弱（|y_min| = [0.82, 1.44] mL O₂·g^?1·h^?1）。组织学分析进一步证实了QB品系中hM3Dq表达的非特异性分布。这表明bGH poly(A)破坏了Q神经元的特异性表达，并削弱了QIH表型。

Bicistronic expression of iCre preserves specificity but produces weak expression and shallow QIH

接下来，研究团队测试了双顺反子策略。QT（T2A）和QI（IRES）品系均实现了Q神经元特异性的iCre表达，但表达强度显著弱于QC品系。相应的，QT和QI小鼠仅能诱导浅度的QIH（QT-hetero |y_min| = [1.36, 2.99] mL O₂·g^?1·h^?1；QI-hetero |y_min| = [1.50, 2.24] mL O₂·g^?1·h^?1）。即使是在纯合子（homo）小鼠中，QIH深度也未能恢复至QC水平。这表明T2A和IRES系统虽然保留了特异性，但其固有的翻译效率限制导致iCre蛋白表达不足。

Deletion of the poly(A) cassette restores QIH depth in homozygotes but shortens duration

最后，研究人员构建了删除poly(A)序列的QD品系。在QD纯合子小鼠中，QIH深度（|y_min| = [2.06, 3.74] mL O₂·g^?1·h^?1）与QC小鼠重叠，表明删除外源poly(A)序列可部分恢复表型。然而，QIH的持续时间（τ_rec）显著短于QC小鼠。QD杂合子小鼠的表达较弱且异质性较高。这提示内源性Qrfppoly(A)信号的活性可能弱于SV40 poly(A)，影响了iCre转录本的稳定性。

综上所述，本研究通过系统性的遗传学改造和生理学表征，确立了poly(A)序列选择在神经元特异性基因表达中的关键地位。研究结果表明，SV40 poly(A)在Qrfp位点能最佳平衡表达特异性和强度，而bGH poly(A)则因可能干扰内源性调控网络而破坏特异性。双顺反子设计虽能保持特异性但受限于翻译效率，而删除poly(A)则揭示了内源性信号在维持表达持续性方面的不足。这些发现超越了传统上将poly(A)序列视为中性元件的认知，强调了其在遗传工具设计中的决定性作用。

该研究的深刻意义在于为神经科学领域的精准遗传操控提供了重要设计原则。它提示研究人员在构建基因敲入模型时，应谨慎评估poly(A)序列与目标基因组环境的兼容性。对于旨在模拟内源性表达模式的研究，SV40 poly(A)或利用内源性信号可能是更优选择；而对于需要强表达的工具（如 Rosa26 位点敲入），bGH poly(A)则可能更合适。未来，结合3'RACE、长读长测序等技术进一步解析poly(A)选择对转录本加工和染色质构象的影响，将有助于更理性地设计遗传工具，推动神经环路功能解析和基因治疗策略的发展。