《Frontiers in Nutrition》：Enhancement of iron, zinc, and calcium bioaccessibility and bioavailability in green gram (Vigna radiata L.) supplemented with buttermilk through phytate reduction: an in vitro dietary evaluation
编辑推荐：
本研究通过体外模拟消化（INFOGEST）与Caco-2细胞模型，验证了阿育吠陀（āyurveda）中佐剂（Anupāna）概念的科学性。结果表明，酪乳（buttermilk）凭借其植酸酶活性，能有效降解绿豆中的植酸，显著提升铁（Fe）、钙（Ca）、锌（Zn）的生物可及性（分别提高68%、57%、23%）与生物利用度，为利用传统饮食智慧改善植物性膳食矿物质吸收提供了有力证据。
引言
植物性食物为人类营养提供了必需的维生素、矿物质、蛋白质和膳食纤维。然而，植物性膳食中的特定化合物，如植酸盐（phytates），会抑制营养素的吸收，从而导致潜在的健康问题。绿豆（Vigna radiata L.）是一种常用的豆类，其植酸含量在0.4%至1.4%之间。绿豆中高水平的植酸会阻碍必需矿物质的吸收。需要系统性地改变膳食方法来解决这一问题。阿育吠陀提到了佐剂（Anupāna）的概念，以增强营养素的可用性并解决营养吸收中的任何缺陷。本研究旨在确定酪乳（Takra）是否可以作为饮食中的营养增强剂，并改善绿豆中营养素的吸收。
材料与方法
研究在Athmic Biotech solutions Pvt. ltd 研发实验室以及Amrita Vishwa Vidyapeetham的Amrita Centre for Advanced Research in āyurveda进行。研究使用了四种样品：未烹饪绿豆、烹饪绿豆、酪乳以及用酪乳处理的烹饪绿豆。绿豆样品采购自Kerala Agricultural University的Onattukara Regional Agricultural Research Station。整个研究过程使用分析级化学品、双蒸水并进行细致的设备清洁。采用INFOGEST体外消化流程，并辅以来自Nice Chemicals Private Limited的酶。消化后以400 rpm离心，并使用ANTON-PAR Multiwave GO微波消解装置进行酸消解，以备ICP-MS分析。
预处理程序
采购的绿豆（Vigna radiata L.）种子被制成植物标本册，并经过植物学专家认证。生绿豆种子经人工分选去除破损、干瘪、变色种子及外来物质。清洗后的种子晒干并在室温（27 ± 10 °C）下于密闭玻璃容器中储存约4周。将100克绿豆种子在蒸馏水中浸泡7小时。浸泡后，去除水分并测量，通过无灰滤纸过滤。将浸泡过的豆粒与所需体积的烹饪用水一起转移至耐热玻璃罐中。每100克浸泡豆粒加入50毫升蒸馏水作为烹饪介质，烹饪后保留此介质以利于均质化。将玻璃罐置于标准压力锅内，在最大功率下高压烹饪10分钟。烹饪后的样品进行均质化，冷藏直至进一步分析，使用500毫克精细研磨的样品进行生物可及性和生物利用度评估。新鲜牛奶从邻近村庄采购，奶牛完全以草为食。牛奶经中火彻底煮沸，冷却后在环境温度下静置过夜。次日早晨，将凝乳与乳清分离。取100毫升凝乳与25毫升蒸馏水搅拌直至脂肪完全分离，得到酪乳。将烹饪绿豆均质物与新鲜制备的酪乳按1:1 (w/v)的标准比例混合，均质化以获得均匀混合物，并立即进行体外消化和矿物质生物可及性分析。
矿物质与植酸含量测定
未烹饪绿豆和新鲜制备的酪乳样品采用硝酸-过氧化氢混合物进行冷酸消解，遵循AOAC矿物质分析标准指南。使用ICP-MS测定铁（Fe）、钙（Ca）和锌（Zn）的浓度。采用水解植酸法测定酪乳的植酸酶活性。植酸酶活性单位（U）定义为在特定测定条件下每分钟催化释放1 μmol无机磷酸盐的酶量。使用Wheeler和Ferrel的分光光度法估计未烹饪绿豆、烹饪绿豆以及用酪乳处理的烹饪绿豆中的植酸盐含量。
生物可及性与生物利用度评估
使用INFOGEST方案对每个样品进行模拟消化。制备唾液、胃液和肠液并调节至特定pH值。评估酶活性和牛胆盐含量。口腔阶段涉及将液体食物与模拟唾液混合并调节至pH 7。胃阶段涉及将口腔食团与模拟胃液混合并调节至pH 3.0。肠道阶段涉及将胃食糜与模拟肠液混合并调节至pH 7。消化后，离心并提取样品用于铁、钙和锌的定量。
使用Caco-2细胞模型评估生物利用度。细胞在补充了10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%抗生素混合物（含青霉素100 U·mL?1、链霉素100 μg·mL?1、两性霉素B 2.5 μg·mL?1）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM-HiMedia）中培养。将细胞（3.0 × 105细胞·孔?1）接种于六孔板，并在37°C、5% CO2环境下适应24小时。将烹饪绿豆和用酪乳处理的烹饪绿豆的消化样品通过0.2 μm Millipore注射器过滤器过滤，以6.25、12.5、25、50和100 μg·mL?1的浓度添加到六孔无菌微孔板中的DMEM培养基中。未处理的细胞作为对照。孵育24小时后，进行ICP-MS分析。
结果
在原料绿豆中，钙的浓度最高（1092.84 ± 0.22 mg·kg?1），其次是铁（59.92 ± 0.14 mg·kg?1）和锌（29.71 ± 0.06 mg·kg?1）。在酪乳中，钙同样是主要的微量营养素（124.19 ± 0.40 mg·kg?1），其次是锌（23.52 ± 0.09 mg·kg?1）和铁（5.36 ± 0.04 mg·kg?1）。酪乳中有机磷酸盐的释放率为1.47 μmol·min?1，酶活性为2.93 U·mL?1。未烹饪绿豆的植酸含量最高（53.08 ± 0.03 μg·mL?1；1.58 ± 0.02 g·100 g?1）。烹饪后植酸水平降至46.42 ± 0.36 μg·mL?1，相当于1.20 ± 0.02 g·100 g?1。用酪乳处理的烹饪绿豆植酸含量进一步显著下降至32.38 ± 0.04 μg·mL?1，相当于0.54 ± 0.01 g·100 g?1。单因素方差分析表明，酪乳对绿豆的去植酸化有显著影响（F统计量 = 1579.33）。
在未烹饪绿豆的消化物中，生物可及性钙浓度最高（523.47 ± 0.60 mg·kg?1），其次是锌（12.49 ± 0.06 mg·kg?1）和铁（10.45 ± 0.39 mg·kg?1）。烹饪绿豆消化物中铁、钙、锌的浓度分别为12.50 ± 0.06 mg·kg?1、387.62 ± 0.23 mg·kg?1和18.19 ± 0.14 mg·kg?1。在酪乳消化物中，钙仍是最丰富的矿物质（92.25 ± 0.20 mg·kg?1），其次是锌（6.73 ± 0.15 mg·kg?1）和铁（3.63 ± 0.02 mg·kg?1）。当烹饪绿豆与酪乳一起消化时，矿物质水平显著增加：铁为27.64 ± 0.45 mg·kg?1，钙为749.98 ± 0.32 mg·kg?1，锌为22.72 ± 0.03 mg·kg?1。
Caco-2细胞模型评估的生物利用度结果显示，未烹饪绿豆消化物的铁、钙、锌生物利用度水平分别为7.09 ± 0.41 mg·kg?1、592.89 ± 0.15 mg·kg?1和19.39 ± 0.01 mg·kg?1。烹饪绿豆消化物分别为8.30 ± 0.02 mg·kg?1、300.31 ± 0.27 mg·kg?1和17.26 ± 0.06 mg·kg?1。酪乳消化物分别为2.78 ± 0.12 mg·kg?1、76.90 ± 0.01 mg·kg?1和3.94 ± 0.06 mg·kg?1。用酪乳处理的烹饪绿豆消化物记录到显著更高的生物利用度水平：铁25.78 ± 0.33 mg·kg?1，钙698.68 ± 0.29 mg·kg?1，锌21.32 ± 0.49 mg·kg?1。统计分析（Mann-Whitney U检验）表明，用酪乳处理的烹饪绿豆与未处理的烹饪绿豆相比，铁、钙、锌的生物可及性和生物利用度均存在统计学显著差异（p值 < 0.05）。与未处理的烹饪绿豆相比，用酪乳处理的样品中铁的生物可及性提高了约121%，生物利用度提高了约211%；钙的生物可及性提高了约93%，生物利用度提高了约133%；锌的生物可及性提高了约25%，生物利用度提高了约24%。
讨论
烹饪绿豆样品中植酸的减少可归因于多种机制：浸泡促进水溶性植酸盐浸出到浸泡介质中，并增加植酸在后续烹饪和酶作用下的分解敏感性；烹饪过程中的加热通过破坏热不稳定性植酸盐和促进水解来降低植酸含量；烹饪可能激活内源性植酸酶；烹饪和浸泡过程中的pH变化可能影响植酸稳定性和植酸酶活性；部分植酸可能浸出到烹饪水中；烹饪诱导的绿豆细胞结构变化可能使植酸分子暴露于酶作用，从而加速其降解。
在酪乳处理的绿豆样品中，植酸减少的作用模式包括：发酵过程中pH降低，通过增强矿物质溶解度和促进内源性或微生物植酸酶（如存在）的作用来促进植酸降解；酪乳的螯合特性可能与植酸竞争矿物质结合位点；发酵诱导的绿豆基质结构变化；以及酪乳和绿豆之间协同相互作用，共同增强去植酸化过程。这些发现与Gupta等人的研究一致，表明具有植酸酶活性的酪乳有潜力降低发酵食品中的抗营养素含量，特别是植酸。
本研究通过标准化INFOGEST体外消化模型和Caco-2细胞摄取评估，验证了阿育吠陀Anupāna概念的科学性。酪乳的掺入显著增强了铁、钙、锌的生物可及性。观察到的铁生物可及性增强可能归因于酪乳的酸性性质和发酵衍生的有机酸，它们通过将三价铁还原为二价铁来提高非血红素铁的利用率。钙生物可及性的显著增加可能由可溶性钙-有机酸复合物（特别是乳酸）的形成来解释。锌生物可及性的增加程度较低，这与早期报告一致，即锌生物可及性受螯合化合物和抗营养因子的强烈影响；酪乳中的发酵和益生菌活性可能通过降解锌结合化合物来部分减轻这些抑制作用。
Caco-2细胞模型证实的更高生物利用度表明，酪乳不仅增强了矿物质溶解度，还促进了细胞摄取。发酵乳制品通过微生物代谢物和有机酸改善铁的生物利用度，这些物质促进矿物质跨肠细胞运输。同样，发酵诱导的pH降低和蛋白质修饰可以通过在肠道转运过程中维持矿物质可溶形式来增强钙的生物利用度。锌生物利用度的适度但显著增加可能与发酵和消化后矿物质稳定性改善以及抑制性膳食成分的竞争减少有关。
根据阿育吠陀原则，佐剂（Anupāna）的功能品质可归因于铁、钙、锌生物可及性和生物利用度的增强。阿育吠陀将Anupāna定义为与饮食或药物一起有意使用的物质，以改善主要物质的利用。在饮食背景下，像酪乳这样的Anupāna有助于分解食物团块、软化、湿润、消化并促进吸收。因此，本研究证明酪乳可以改善食物分解，使更多表面积暴露于酶，软化食物，帮助消化，并使营养素更容易穿过肠上皮细胞，促进有效循环。
在阿育吠陀饮食学原则（Asta āhāra Vidhivise?āyatanāni）框架内，结合效应（sa?yoga），特别是酪乳和绿豆的协同或拮抗作用，在影响必需微量营养素的生物利用度方面起着重要作用。这种关联可能通过降低绿豆中的抗营养因子（如植酸）来增强矿物质溶解度并支持肠道健康。
结论
酪乳（作为去植酸化剂，凭借其固有的植酸酶活性）与绿豆之间的相互作用，导致了生物可及性的增强并改善了营养素的可用性。本研究通过证明特定Anupāna（酪乳）对绿豆中铁、钙、锌等必需微量营养素的生物可及性和生物利用度的显著增强作用，强化了阿育吠陀原则。将酪乳纳入饮食成为一种将营养次优饮食转化为高营养饮食的有效且经济策略。采纳阿育吠陀饮食学可作为解决营养不良及相关疾病的一种可持续方法。这些原则应通过健康教育和专业人士咨询在个人层面进行传播，并通过补充性营养政策在国家层面确保质和量的营养充足性。
