IREB2基因D826V点突变通过铁代谢紊乱诱导脂肪组织脂质生成的机制研究

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：The D826V point mutation in IREB2 induces lipogenesis in adipose tissues

本研究发现IREB2基因D826V点突变（Ireb2D826V/D826V）通过诱导IREB2蛋白降解、上调铁蛋白重链（FTH1）表达并导致铁积聚，进而激活脂肪酸（由ACACA、ACLY、FASN介导）和甘油三酯（与EGR1、FGFR4相关）生物合成关键基因的表达，最终促进脂肪生成和体重增加。该研究首次揭示了IREB2-FTH1-铁积聚轴在脂质代谢中的新作用，为理解铁代谢与肥胖的关联提供了新的分子机制视角。

　　

背景介绍

IREB2（铁反应元件结合蛋白2）是一种RNA结合蛋白，通过调节铁蛋白表达在细胞铁摄取和储存中起关键作用。研究表明，IREB2基因突变可诱导IREB2蛋白降解，导致FTH1蛋白表达上调，从而促进铁储存。本研究首次探讨了Ireb2^D826V/D826V突变对脂质生物合成的潜在机制。随着饮食模式、环境因素和遗传易感性的改变，肥胖的患病率日益上升，其中遗传因素是突出且不可控的决定因素。然而，遗传因素与肥胖关系的机制尚未完全阐明，亟需深入研究。IREB2通过结合靶mRNA（如转铁蛋白受体TFRC、铁蛋白重链FTH1和轻链FTL）中的铁反应元件（IREs）协调铁稳态。IREB2基因突变可诱导IREB2蛋白降解，进而上调FTH1表达，可能导致细胞和组织铁积聚。越来越多的证据表明，组织铁积聚可能参与肥胖、2型糖尿病、高脂血症和非酒精性脂肪肝等代谢疾病的发病机制，这些疾病与代谢组织中过度的脂质生物合成明显相关。然而，探索铁积聚与脂质生物合成潜在联系机制的研究较少。以往研究提出，铁过载可能增加FTH1表达并激活sgk-1/FATP1/4信号通路，从而增强脂肪酸摄取和转运过程。但过量铁和FTH1激活这些信号通路并影响脂质生物合成的具体机制仍不清楚。单独考虑脂肪酸摄取和转运的增加并不能完全阐明其对上述病理条件下组织脂质积聚的影响。FTH1在铁过载条件下直接增强Fe³⁺铁的积聚，同时降低游离Fe²⁺铁水平。FTH1表达升高与肥胖发展和脂肪生成过程呈正相关。肥胖和腰围较大的个体常常表现出更高的FTH1表达。证据表明FTH1可能通过调节铁积聚直接调节脂质生物合成；可以合理假设，诱导铁积聚的FTH1表达升高可能直接增强脂质生物合成过程，从而促进脂质积聚。然而，FTH1影响脂质生物合成的精确机制仍不清楚。为阐明FTH1在脂质生物合成中的作用机制，已有研究确定FTH1调节3T3-L1脂肪细胞的脂肪生成和分化过程。此外，FTH1缺陷似乎能减轻高脂诱导的脂质积聚和肥胖相关紊乱，但这是通过在巨噬细胞中特异性敲除FTH1抑制其炎症激活实现的，仍缺乏FTH1在脂质生物合成中直接作用的证据。基于上述证据，可以合理假设，诱导FTH1表达上调的IREB2降解可能显著促进脂质生物合成的直接刺激。本研究旨在探讨其中涉及的潜在机制。在先前研究中，我们在一名被诊断患有NDCAMA（早发性神经退行性病变伴舞蹈手足徐动症和小细胞性贫血）并表现体重异常的患者中发现了一种新的IREB2 c.2477A>T（p.D826V）变异。该变异预测并通过促进其降解 destabilize IREB2蛋白。为研究其致病作用，我们利用CRISPR-Cas9技术生成了Ireb2^D826V/D826V小鼠。值得注意的是，在饲喂试验中，与同龄野生型（WT）小鼠相比，Ireb2^D826V/D826V小鼠表现出体重增加、脂肪量增加和脂肪细胞肥大。我们假设Ireb2^D826V/D826V突变可能影响脂肪细胞的脂质代谢，但其潜在机制尚不清楚。本研究整合转录组测序和非靶向代谢组学，检测Ireb2^D826V/D826V突变对脂肪生成和脂肪分解过程的影响。此外，通过体内和体外实验阐明相关的脂质代谢过程和潜在机制。我们的发现为肥胖的病理生理学和Ireb2^D826V/D826V突变的作用提供了机制见解。

材料与方法

动物模型

Ireb2^D826V/D826V敲入小鼠模型使用CRISPR-Cas9基因组编辑系统由Cyagen公司（中国广州）开发，策略与我们之前的研究一致。简言之，以BAC克隆RP23-382D20为模板创建同源重组供体DNA，其中包含带有D826V突变的小鼠Ireb2基因组序列，使用高保真Taq DNA聚合酶扩增。设计两个sgRNA靶向小鼠Ireb2基因：sgRNA1: 5′-CTT AGG TAT ATA GTC AAG GCT GG-3′ 和 sgRNA2: 5′-AAT ACA GAT GAC ACG AGA CAG GG-3′。将包含这些sgRNA（各浓度2 pmol/μL）、同源重组模板DNA（15 ng/μL）和Cas9蛋白（30 ng/μL）的混合物显微注射到受精的小鼠卵母细胞中，产生F0代杂合突变体。F0杂合小鼠互交产生F1后代。通过从尾组织提取基因组DNA，进行PCR扩增和Sanger测序鉴定纯合Ireb2^D826V/D826V小鼠。测序引物为：正向5′-CAA GAG GCA CAT TTG CAA ACA TCA-3′，反向5′-CTT CAC TGC GTC CAT ACA GAC TTC-3′。Ireb2^D826V/D826V小鼠（每组5只）和年龄匹配的WT对照（每组5只）在无特定病原体（SPF）条件下饲养。动物饲养在12小时光/暗循环、温度控制（22°C ± 2°C）、相对湿度55% ± 15%的环境中。每笼饲养4只小鼠，配备笼架、水瓶和标准饮食（MD17121, Medicience, 中国，粗蛋白25.0%，粗脂肪10.0%，粗纤维5.0%，钙1.5%，磷1.0%）。所有小鼠自由获取标准食物和水。本研究从8周龄开始每周监测WT和Ireb2^D826V/D826V小鼠体重。系统记录8周（青年成年期开始）、12周（青年成年期）和16周（中年成年期）的体重，以阐明WT和Ireb2^D826V/D826V小鼠之间的差异。这些时间点旨在捕捉成年早期的代谢特征并监测随时间推移的潜在表型变化进展。在16周龄（完全成年期），所有小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）。小鼠禁食（IPGTT通常禁食12小时，ITT禁食4小时）。在零时从尾静脉测定基线血糖水平。对于IPGTT，腹腔注射葡萄糖溶液（G8150, Solarbio, 中国），剂量为2 g/kg体重。注射后30、60、90和120分钟测量血糖以监测葡萄糖清除。在ITT中，注射胰岛素（I8040, Solarbio, 中国），剂量为0.75 U/kg体重。然后在15、30、60和90分钟测量血糖水平以评估降血糖反应。随后，所有小鼠在异氟烷麻醉下安乐死，收集附睾脂肪组织（epWAT）和皮下脂肪组织（SAT）用于进一步分析，包括计算脂肪量（脂肪组织重量与体重的比率）、苏木精-伊红（H&E）染色、蛋白质印迹分析、代谢组学分析和RNA测序。此外，收集血清和epWAT样本测量甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）浓度。

RNA测序

从Ireb2^D826V/D826V和WT小鼠的epWAT中提取总RNA，每组包括三个雄性样本，使用Trizol试剂（15596-018, Invitrogen, 美国）。对于RNA测序（RNA-seq）分析，使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, CA, 美国）评估RNA样品的完整性和浓度。随后，构建cDNA文库并在Novaseq X平台（杭州星旋科技有限公司，中国）上进行测序。每个样本产量超过6.11 Gb，碱基调用质量分数Q20%超过98.5%，Q30超过96.04%。使用Fastp对原始测序读数进行质量过滤产生clean reads，然后使用HISAT2比对到小鼠参考基因组（GRCm38/mm10），比对率在91.85%至95.1%之间。共鉴定出20,162个表达基因。使用DESeq2确定差异表达基因（DEGs），错误发现率（FDR）阈值小于0.05，绝对log₂倍数变化标准大于1。使用在线平台（https://magic-plus.novogene.com/）进行数据分析和可视化，包括主成分分析（PCA）。PCA结果表明基因型是变异的主要来源，前两个主成分（PC1占28.8%，PC2占23.2%）共同解释了总方差的52.0%。支持这些发现的RNA-Seq数据已存入CNSA公共数据集（https://db.cngb.org/cnsa/），登录号为CNP0008452。

代谢组学分析

对来自Ireb2^D826V/D826V和WT小鼠的epWAT进行非靶向代谢组学分析。分析采用高效液相色谱（HPLC）系统结合质谱仪（Thermo Fisher Scientific, 德国）并使用亲水相互作用液相色谱（HILIC）柱（ZIC-pHILIC, 150 × 4.6 mm, 5 μm粒径; Hichrom Ltd., 英国）。使用Xcalibur 2.1.0软件包（Thermo Fisher Scientific, 英国）管理数据采集，并使用MzMatch软件（IDEOM）将Xcalibur产生的信号峰转换为数值数据以供后续处理和分析。代谢物鉴定遵循代谢组学标准倡议（MSI）水平。使用在线平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）进行KEGG分析、PCA、GSEA和差异代谢物分析。支持非靶向代谢组学分析发现的数据已存入CNSA公共数据集（https://db.cngb.org/cnsa/），登录号为CNP0008452。

蛋白质印迹

通过蛋白质印迹分析检测从epWAT和脂肪细胞中提取的蛋白质。从小鼠切取100 mg epWAT或由SVF来源的前脂肪细胞诱导的1 × 10⁶个脂肪细胞，使用300 μL RIPA裂解缓冲液（G2002, Servicebio, 中国）补充1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）（P0100, Solarbio, 中国）在4°C裂解。随后，裂解混合物在12000 g/min离心15分钟，收集蛋白质上清液，并使用BCA蛋白质定量试剂盒（#E112, Vazyme, 中国）测定蛋白质浓度。蛋白质通过8%或10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，随后用5%脱脂牛奶（GC310001, Servicebio, 中国）封闭膜。然后将膜与特异性针对IREB2（1:1000 TBST稀释, 29976-1-AP）、FTH1（1:1000 TBST稀释, 11682-1-AP）、ACACA（1:1000 TBST稀释, 21923-1-AP）、ACLY（1:1000 TBST稀释, 15421-1-AP）、FASN（1:1000 TBST稀释, 10624-2-AP）、EGR1（1:1000 TBST稀释, 55117-1-AP）、FGFR4（1:1000 TBST稀释, 11098-1-AP）和β-肌动蛋白（1:3000 TBST稀释, 20536-1-AP）的一抗（均来自Proteintech公司，中国）孵育，随后与HRP标记的山羊抗兔（1:3000稀释, AS014）和HRP标记的山羊抗小鼠（1:3000 TBST稀释, AS115）二抗（Abclonal公司，中国）孵育。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）量化相对蛋白质表达水平。

切片染色和TG、FFA检测

采用与先前研究一致的方法进行组织学和生化分析。简言之，从WT和Ireb2^D826V/D826V小鼠收集的epWAT和SAT用10%中性缓冲福尔马林（G1101, Servicebio, 中国）保存。保存的组织随后石蜡包埋。使用组织处理器制备5 μm厚度的切片，并用H&E溶液染色。使用CaseViewer软件（3D HISTECH, 匈牙利）进行进一步分析和成像。使用从南京建成公司购买的特异性检测试剂盒（TG检测用A110-1-1，FFA检测用A042-2-1）按照说明书定量血清、epWAT和脂肪细胞中的TG、TC和游离脂肪酸（FFA）浓度。

脂肪组织铁检测

使用Abcam的铁检测试剂盒（ab83366）按照说明书测量脂肪组织中的铁水平。将脂肪组织（0.1 g）用1 mL铁测定缓冲液匀浆，然后在16,000 rpm，4°C离心10分钟。使用96孔微孔板读数器读取上清液在OD 570 nm处的吸光度。根据制造商指南计算总铁水平。

成熟脂肪细胞的诱导和铁螯合剂处理

根据已发表报告，从Ireb2^D826V/D826V和WT小鼠的基质血管组分（SVFs）中分离前脂肪细胞。这些细胞在杜尔贝科改良 Eagle 培养基（DMEM）（SH30022.01B, Hyclone, 美国）中培养，补充1%抗生素（G4003, Servicebio, 中国）和10%胎牛血清（FBS）（E600001, 生工生物工程股份有限公司, 中国），在37°C、环境氧水平和5% CO₂的加湿培养箱中。使用含有胰岛素（HY-P73243, 10 mg/mL, Medchemexpress, 中国）、地塞米松（HY-14648, 10 μM, Medchemexpress, 中国）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（HY-12318, IBMX, 0.5 M, Medchemexpress, 中国）、吲哚美辛（HY-14397, 125 nM, Medchemexpress, 中国）和罗格列酮（HY-17386, 1 μM, Medchemexpress, 中国）的培养基诱导Ireb2^D826V/D826V和WT前脂肪细胞分化为脂肪细胞，持续5天，随后用胰岛素（10 mg/mL）处理另外2天。对于用铁螯合剂去铁胺（HY-B1625, Medchemexpress, 中国）处理，浓度为30 μM，Ireb2^D826V/D826V细胞使用上述补充了去铁胺的培养基诱导。诱导后，对脂肪细胞进行油红O染色、TG和FA水平检测、荧光定量PCR和蛋白质印迹分析。

统计分析

采用Student t检验评估组间差异。数据表示为平均值±标准误。随后使用Tukey事后检验，利用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。这项初步表型研究的样本量（每组基因型n = 5）是基于新型小鼠模型探索性研究的常见实践并遵循3R原则中的减少原则确定的。虽然未进行先验功效分析，但对主要结局（16周时体重）的事后分析显示，观察到的大效应量（Cohen's d = 4.03）导致统计功效 >99.9%（α = 0.05），表明样本量足以检测到报告的表型。

结果

Ireb2^D826V/D826V突变增加了小鼠的体重和脂肪含量

为建立IREB2表达与体重增加之间的相关性，分析了来自16名瘦和16名肥胖患者脂肪组织中的人IREB2 mRNA表达水平（GSE59034）。如图1A所示，肥胖个体的脂肪组织IREB2 mRNA表达显著低于瘦个体。这表明IREB2基因可能在肥胖发展中起负调控作用。在我们建立的Ireb2^D826V/D826V小鼠饲喂期间，观察到Ireb2^D826V/D826V小鼠与年龄匹配的WT小鼠相比表现出体重增加（图1B）。随后的脂肪量分析显示，Ireb2^D826V/D826V小鼠拥有比WT小鼠更多的epWAT和SAT（图1C）。类似地，Ireb2^D826V/D826V小鼠表现出epWAT、SAT和肝脏重量增加，而腓肠肌重量与WT小鼠相当（表1）。这表明Ireb2^D826V/D826V突变可能影响与脂质积聚相关的组织重量。此外，Ireb2^D826V/D826V小鼠epWAT中的TG浓度（图1D），以及血清中的TG（图1E）和TC浓度（图1F）表现出与脂肪量和体重相似的趋势。尽管有这些观察结果，Ireb2^D826V/D826V小鼠的食物摄入量与WT小鼠相当（图1G）。Ireb2^D826V/D826V小鼠表现出空腹血糖水平适度升高（图1H）和葡萄糖耐量受损（图1I），而胰岛素耐量与WT小鼠相当（图1J）。这表明与Ireb2^D826V/D826V突变相关的肥胖发展伴随着葡萄糖代谢功能障碍和轻度胰岛素抵抗。此外，在Ireb2^D826V/D826V小鼠的epWAT和SAT的HE染色切片中发现了肥大的脂肪细胞，与WT小鼠相比（图1K, L）。这些发现暗示Ireb2^D826V/D826V突变可能促进脂质积聚而不增加能量摄入，但其潜在机制仍不清楚。

Ireb2^D826V/D826V突变激活了epWAT中的脂质生物合成过程

为阐明Ireb2^D826V/D826V突变影响脂质积聚的潜在机制，收集来自Ireb2^D826V/D826V和WT小鼠的epWAT并进行RNA测序分析。生成的RNA测序数据随后进行主成分分析（PCA）（图2A），WT和Ireb2^D826V/D826V组样本显示出合格的分离。差异基因表达分析显示，与WT小鼠相比，Ireb2^D826V/D826V小鼠epWAT中263个基因上调，138个基因下调（图2B）。为进一步阐明这些差异表达基因（DEGs）的功能意义，使用基因本体论（GO）方法分析263个上调的DEGs。如图2C, D所示，这些上调的DEGs显著富集于与脂质生物合成相关的功能，包括脂肪酸生物合成过程和脂质生物合成过程的调节等。基于通过RNA测序鉴定的与脂肪酸和脂质生物合成相关的DEGs，通过蛋白质印迹分析评估这些基因的功能特征。如图2E-H所示，在Ireb2^D826V/D826V小鼠的epWAT中，脂肪酸相关酶如ACACA、ACLY和FASN蛋白，以及甘油三酯相关蛋白包括FGFR4和EGR1表达上调。这表明Ireb2^D826V/D826V突变通过上调与脂质生物合成相关的酶来增强脂质生物合成功能。基于我们之前的研究，该研究确定D826V突变是IREB2蛋白降解的触发因素，我们分析了epWAT中IREB2蛋白表达水平。我们的研究结果显示，与WT小鼠相比，IREB2蛋白水平显著降低，FTH1蛋白水平增加，这与之前的报告一致。FTH1的上调，一种参与铁代谢的关键蛋白，导致细胞内铁水平增加，这与能量消耗减少和脂质生物合成增加相关。我们的研究结果表明，与WT小鼠相比，Ireb2^D826V/D826V小鼠epWAT和SAT中的铁水平升高，这与IREB2蛋白水平降低和FTH1表达增加相对应（图2I）。基于这些发现，我们假设由Ireb2^D826V/D826V突变引起的epWAT中铁代谢紊乱增强了脂肪酸和甘油三酯的生物合成过程。

代谢组学鉴定Ireb2^D826V/D826V突变增加了脂质生物合成过程

为确定脂质生物合成酶表达增加是否影响epWAT中的代谢谱，使用来自Ireb2^D826V/D826V和WT小鼠的epWAT样本进行代谢组学分析。如图3A所示，脂质和类脂分子构成了总代谢物的显著部分。代谢物的主成分分析（PCA）揭示了Ireb2^D826V/D826V和WT小鼠之间不同的代谢谱（图3B）。此外，代谢组学数据的基因集富集分析（GSEA）表明Ireb2^D826V/D826V突变与代谢通路呈正相关（图3C）。随后的差异代谢物分析鉴定出45个上调和23个下调的代谢物（图3D）。KEGG通路富集分析进一步将这些代谢物中的大多数分类为与脂质代谢相关（图3E）。为确定Ireb2^D826V/D826V突变是否导致脂肪酸和甘油三酯生物合成增加，使用热图说明各种代谢物（图4）。脂肪酸如顺式10-十七碳烯酸、大风子酸、十五烷酸、异月桂酸和肉豆蔻酸在Ireb2^D826V/D826V小鼠的epWAT中显著升高。此外，其他脂质生物合成组分，包括3-（甲硫基）丁酸乙酯、亚麻酸乙酯、蝙蝠醇和单油精，在这些小鼠中也显示水平增加。这些发现表明Ireb2^D826V/D826V突变增强了epWAT中的脂质生物合成，可能是