布鲁氏菌A19 ΔbtpB突变株通过增强免疫原性加速宿主清除的机制研究

《Frontiers in Immunology》：Enhanced immunogenicity of the Brucella A19 ΔbtpB mutant leads to accelerated clearance in the host

本文系统研究了布鲁氏菌A19疫苗株的btpB基因缺失突变体（ΔbtpB）的生物学特性。研究发现，ΔbtpB在体外应激抵抗力减弱，但在小鼠模型中展现出显著增强的免疫原性：诱导更强的Th1免疫反应（IFN-γ、IL-2升高）、CD8+T细胞增殖和NK细胞毒性活性，同时脾脏细菌载量显著降低且清除加速。这表明BtpB作为T4SS效应因子在免疫抑制中起关键作用，ΔbtpB有望成为更安全的布鲁氏菌病候选疫苗。

　　

布鲁氏菌A19 ΔbtpB突变株的构建与免疫特性评估

引言

布鲁氏菌（Brucella）是一种革兰阴性兼性胞内寄生菌，可感染人类和多种家畜（牛、羊、猪、骆驼等）及野生动物（鹿、野牛等），引起流产、不孕和关节炎等症状，造成重大经济损失和公共卫生风险。目前尚无有效的人用布鲁氏菌疫苗，而动物疫苗均为减毒活疫苗株（如布鲁氏菌Rev.1、A19、RB51）。这些疫苗虽有一定效果，但仍存在安全性风险和干扰血清学诊断等缺点。因此，研发更安全、更理想的疫苗对布鲁氏菌病的防控至关重要。当前新型布鲁氏菌疫苗的研究方向主要聚焦于更安全的亚单位疫苗和基于现有疫苗株的基因工程缺失疫苗。深入了解布鲁氏菌组分进入宿主后的作用以及感染过程中各类免疫细胞亚群的功能，对指导新型布鲁氏菌疫苗的研发具有重要意义。

布鲁氏菌的防控依赖于细胞免疫，主要涉及激活的抗原呈递细胞（巨噬细胞、树突状细胞）、CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞。布鲁氏菌抗原诱导T辅助1（Th1）细胞因子的产生，因此Th1免疫反应在清除布鲁氏菌感染中至关重要。布鲁氏菌已进化出多种针对不同宿主免疫细胞的免疫逃逸和免疫抑制能力。BtpB是布鲁氏菌Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域蛋白，也是IV型分泌系统（T4SS）的重要效应因子。已知布鲁氏菌TIR结构域蛋白（包括BtpA和BtpB）能破坏宿主的Toll样受体（TLR）信号，从而抑制先天免疫。近期研究揭示，BtpA和BtpB通过水解NAD⁺来调节宿主细胞能量代谢，导致NADH和ATP耗竭。BtpB特异性调节PDIA4表达以改变巨噬细胞中NAD⁺/NADH水平。此外，先前研究表明，在布鲁氏菌感染巨噬细胞过程中，BtpB通过减少自噬溶酶体的形成来抑制自噬，抑制巨噬细胞中TLR2和TLR4的表达，并削弱NLRP3炎症小体的激活，从而在布鲁氏菌感染期间抑制宿主免疫反应。还有报道称，BtpB通过抑制小鼠树突状细胞（DC）表面MHC-II分子的表达来损害DC活化，并破坏NF-κB核转位，表明其与宿主炎症反应和抗原呈递相关。总之，BtpB可在布鲁氏菌感染期间诱导宿主免疫抑制。

材料与方法

本研究在布鲁氏菌流产菌A19株基础上，利用同源重组方法成功构建了无痕ΔbtpB突变株。通过体外生长曲线和应激抵抗实验（酸性pH 5.4、热应激42 °C、氧化应激1 mM H₂O₂、高渗2 M山梨醇和多粘菌素B 200 μg/mL）评估了突变株的生物学特性。利用小鼠免疫模型（BALB/c小鼠腹腔接种1×10⁷CFU的A19或ΔbtpB），通过脾脏细菌载量、脾脏和肝脏病理损伤评估毒力。通过检测血清抗体水平（总IgG、布鲁氏菌特异性IgG、IgG2a/IgG1比值）、细胞因子水平（IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-2、IL-4、IL-1β、IL-10）以及流式细胞术分析脾脏淋巴细胞亚群（CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、Th1细胞、Th2细胞、NK细胞）的增殖和活化状态（如CD107a脱颗粒）来评估免疫效力。

结果

ΔbtpB突变株生长特性未改变但体外应激抵抗力降低

成功构建的ΔbtpB突变株在体外96小时生长曲线与野生型A19无显著差异，对巨噬细胞（RAW264.7）的粘附和胞内增殖能力也未见改变。然而，ΔbtpB对酸性、氧化和高渗应激的抵抗力显著减弱，但对热应激和多粘菌素B的抵抗力与A19无差异。

ΔbtpB在小鼠脾脏中清除更快且病理反应减弱

小鼠感染实验显示，ΔbtpB感染组小鼠的脾脏/体重比值在感染后4周（wpi）即接近正常，而A19感染导致持续性脾肿大。脾脏细菌载量分析表明，ΔbtpB在脾脏的定植量从2 wpi起显著低于A19，并在6 wpi时无法检出，而A19仍有残留。体重监测显示ΔbtpB未显著影响小鼠体重增长，而A19减缓了体重增长速率。组织病理学检查发现，ΔbtpB引起的脾脏病理损伤（如脾小结结构破坏、纤维组织增生、淋巴细胞坏死）较A19轻，肝脏病理变化两组相似。

ΔbtpB突变株升高小鼠血清抗体水平

ELISA检测显示，ΔbtpB感染小鼠在多个时间点的血清总抗体水平和布鲁氏菌特异性IgG水平显著高于A19感染组，表明体液免疫增强。此外，ΔbtpB感染组在感染早期（1-2 wpi）的IgG2a/IgG1比值显著高于A19组（A19组在2 wpi甚至低于PBS对照组），提示免疫反应向Th1极化。

ΔbtpB突变株上调多种血清细胞因子水平

Th1相关细胞因子检测显示，ΔbtpB感染组血清中IFN-γ、TNF-α和IL-2水平在多个时间点显著高于A19组，而IL-12水平无显著变化。Th2相关细胞因子中，IL-4水平仅在4 wpi略有升高，IL-10水平无组间差异。促炎细胞因子IL-1β水平在ΔbtpB组普遍升高。这些结果表明ΔbtpB增强了Th1极化免疫反应，对Th2反应影响不显著。

ΔbtpB突变株在感染早期诱导CD8⁺T细胞扩增并增强细胞毒性

流式细胞术分析显示，ΔbtpB感染组在1 wpi时脾脏CD8⁺T淋巴细胞比例（>28%）和脱颗粒CD8⁺T细胞（CD8⁺CD107a⁺）比例显著高于A19组（~23%），但此差异在2 wpi和4 wpi时消失。CD4⁺T细胞比例在两组间无显著差异，但A19组在1 wpi时低于PBS对照组。这表明ΔbtpB在感染初期引发了更强的细胞毒性T淋巴细胞反应。

ΔbtpB突变株在感染早期引发更强的Th1和Th2反应

ΔbtpB感染组在1 wpi时脾脏Th1淋巴细胞（CD4⁺IFN-γ⁺）比例显著高于A19组。Th2淋巴细胞（CD4⁺IL-4⁺）比例在ΔbtpB组于1 wpi升高，但在2 wpi时降至低于A19水平。这表明ΔbtpB在感染早期能更强地激发Th1和Th2反应，但Th2反应在中后期减弱。

ΔbtpB突变株不影响NK细胞比例并在感染中后期引发更强细胞毒性

ΔbtpB感染对脾脏NK细胞（CD3^-CD49b⁺）比例无显著影响。相反，A19感染导致2 wpi时NK细胞比例显著降低（4 wpi时恢复正常）。NK细胞毒性（CD3^-CD49b⁺CD107a⁺）分析显示，ΔbtpB感染组在2 wpi和4 wpi时的脱颗粒水平均显著高于A19组。脾细胞培养上清中NK细胞活化相关细胞因子IL-15和IL-18的水平在ΔbtpB组（尤其在4 wpi）也显著升高。这表明ΔbtpB能维持NK细胞数量并增强其在中后期的细胞毒性功能。

讨论

本研究成功构建了无痕ΔbtpB突变株。体外实验表明其生长、粘附及胞内增殖能力与A19无异，但应激抵抗力减弱。小鼠模型显示ΔbtpB毒力减弱（脾脏载量低、清除快），并引发更强的免疫反应：包括Th1极化（血清IFN-γ、IL-2升高，脾脏Th1细胞增多）、早期CD8⁺T细胞活化和NK细胞毒性增强，以及部分体液免疫增强。结果表明A19感染可在2 wpi（细菌载量峰值期）引起多种免疫细胞（CD4⁺T细胞、Th1、Th2、NK）数量和功能的暂时抑制，而ΔbtpB的免疫抑制效应较弱。BtpB作为重要的免疫抑制因子，其缺失通过增强宿主细胞免疫（尤其Th1和细胞毒性反应）加速了细菌清除。ΔbtpB展现出的高免疫原性和低残留毒力特点，使其成为有潜力的布鲁氏菌病减毒活疫苗候选株。同时，靶向BtpB也可能为开发人和动物布鲁氏菌病的新型治疗策略提供方向。