《Frontiers in Immunology》：Meningeal lymphatic vessel dysfunction exacerbates brain injury in CVST mice via endoplasmic reticulum and oxidative stress pathways
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本文揭示了脑膜淋巴管（mLVs）功能障碍在脑静脉窦血栓形成（CVST）后脑损伤中的关键作用。研究发现，mLVs功能障碍通过激活内质网应激（ER stress）与氧化应激（OS）通路，加剧神经炎症、神经元凋亡及脑组织损伤。应用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）可有效逆转上述病理改变，提示靶向mLVs或为CVST相关脑损伤的潜在治疗策略。
引言
脑静脉窦血栓形成（CVST）是一种罕见的脑血管疾病，约占所有脑卒中的0.5%至1%，在儿童和青少年中更为常见。其病因复杂，已知危险因素包括产褥期、口服避孕药的使用和全身性炎症等。近年来，CVST的发病率呈逐渐上升趋势，部分与某些呼吸道感染的暴发有关。CVST的临床表现非特异性，主要取决于静脉阻塞的范围和位置，常导致非特异性症状和高误诊率。目前的治疗选择仍然有限，抗凝治疗是主要的治疗手段。患者的预后差异很大，及时恢复静脉流出对于最小化不可逆的脑损伤和长期神经功能缺损至关重要。
2015年，Louveau等人发现并验证了小鼠脑膜淋巴管（mLVs）的存在，并阐明了它们在神经系统疾病发生和发展中的作用。除了促进脑脊液引流和代谢废物清除外，mLVs为中枢和外围免疫系统提供了直接的通讯途径，从而有助于免疫监视和维持颅内免疫稳态。大量文献表明，mLVs在控制创伤性脑损伤和其他神经系统疾病后的神经炎症中起着至关重要的作用。在创伤性脑损伤小鼠模型中，增强脑膜淋巴功能可减少炎症并减轻认知障碍。同样，在动脉性卒中模型中，脑膜淋巴管影响卒中后的炎症反应，进而影响功能恢复。在蛛网膜下腔出血中，脑膜淋巴功能受损会加剧脑水肿、炎症和神经元凋亡，从而加重脑损伤。
CVST诱导的脑损伤机制涉及多个相互关联的病理生理过程，形成恶性循环。脑静脉系统内的血栓形成导致窦腔狭窄或闭塞，损害脑静脉循环并阻碍脑脊液吸收。由此产生的静脉高压损害血脑屏障并诱发脑组织缺血缺氧损伤。实质和血脑屏障的损伤进一步触发小胶质细胞和中性粒细胞等炎症细胞的激活，从而促进炎症级联反应。活化的小胶质细胞和中性粒细胞释放多种细胞因子，包括白细胞介素（IL）-1、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）。这些细胞因子的分泌加剧了神经元损伤。此外，NLRP3等炎症小体被激活，促进炎症介质的成熟和释放，并诱导神经元焦亡。Ding等人利用CVST小鼠模型发现，内质网（ER）应激和氧化应激可以共同激活炎症小体通路并在CVST后触发焦亡。在ER应激期间，某些信号分子直接激活炎症通路。例如，在这些条件下产生的错误折叠或未折叠蛋白激活NLRP3炎症小体，这是一种多蛋白复合物，可促进炎性细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，从而诱导局部或全身性炎症反应。然而，mLVs在CVST等脑静脉疾病中的潜在作用及其作用机制在很大程度上仍未得到探索。本研究旨在探讨mLVs是否通过激活ER和氧化应激来影响CVST后（第2天）的炎症过程，从而影响预后。本研究进一步寻求减轻CVST诱导的脑损伤的新治疗方法。
材料与方法
本研究使用了65只雄性C57BL/6J小鼠（8-10周龄，体重22-25克），随机分为四组：假手术组、CVST组、CVST合并颈深淋巴结结扎组（CVST + Ligation）以及4-苯基丁酸（4-PBA）干预组。通过诱导上矢状窦血栓形成来建立CVST模型。所有样本收集和实验检测均在建模后2天进行。采用神经行为学评估、组织病理学染色、免疫荧光、蛋白质印迹、逆转录定量聚合酶链反应、酶联免疫吸附试验和生物信息学分析来综合评估神经功能、脑损伤、炎症反应、ER/氧化应激通路中的关键分子表达以及mLVs功能障碍后相关信号通路的变化。
结果
脑膜淋巴管功能障碍加剧CVST小鼠的脑损伤
与CVST组相比，CVST+结扎组小鼠表现出更严重的神经功能缺损、加重的组织病理学脑损伤、增加的神经元丢失和增强的细胞凋亡。激光散斑成像显示，与CVST组相比，CVST+结扎组的脑血流灌注显著减少。旷场试验进一步证明，淋巴结扎显著加剧了CVST小鼠的神经功能缺损。组织病理学分析显示，HE和尼氏染色均表明CVST和CVST+结扎组存在脑损伤伴出血、神经元萎缩和神经元密度降低，结扎进一步加剧了CVST诱导的脑出血和神经元损伤。此外，TUNEL检测表明两组均诱导了脑组织细胞凋亡，结扎组表现出更严重的凋亡性细胞死亡。GFAP和NeuN的分析显示，两组中GFAP表达上调而NeuN表达下调，表明CVST和CVST+结扎均诱导神经元损伤，且结扎进一步加剧了CVST诱导的损伤。免疫荧光染色显示，CVST后IBA1、iNOS和CD68表达升高，结扎组上调更明显，而CD206表达无变化。BAX和BCL2免疫荧光强度的改变进一步表明脑膜淋巴功能障碍增强了凋亡诱导。这些发现证明CVST触发神经炎症激活，导致凋亡和神经元坏死，而淋巴结扎诱导的脑膜淋巴功能障碍加剧了这一过程。
通过转录组学分析观察到mLVs功能障碍后内质网应激/氧化应激相关通路的相关改变
为了阐明脑膜淋巴功能障碍触发神经炎症激活的机制，研究人员对数据集GSE245455进行了转录组学分析。与假手术组相比，CVST组表现出大量差异表达基因（DEGs）。KEGG富集分析显示，上调基因显著集中在炎症和免疫相关通路，如细胞因子-细胞因子受体相互作用和病毒蛋白-细胞因子相互作用。相反，下调基因主要涉及神经功能通路，包括突触组织和神经递质传递。GO富集结果表明，CVST诱导的关键生物学过程改变包括增强的炎症反应和增加的转录调控活性。GSEA结果进一步表明，在CVST条件下，内质网应激、氧化应激和炎症反应通路被显著激活。
为了研究脑膜淋巴管的作用，研究人员进一步利用自己的转录组数据比较了CVST合并淋巴结扎与单纯CVST模型的基因表达谱。KEGG通路分析显示，CVST结扎组的差异基因显著富集于应激和存活信号通路，如钙信号、PI3K-Akt、MAPK和cAMP。同时，FoxO信号和AGE-RAGE信号被特异性富集，表明抗氧化防御和氧化应激反应的激活。GO分析表明，差异基因在功能上集中于神经发育和可塑性过程，包括轴突发生、神经发生调控、神经元迁移以及学习和记忆。在细胞定位上，它们富集于突触后膜和离子通道复合物。在分子功能上，这些基因与离子门控通道和神经递质受体活性相关。这些结果表明CVST结扎不仅诱导了广泛的细胞应激和代谢失调，还特异性地影响了神经元的结构和功能完整性。
为了验证脑膜淋巴管在内质网应激/氧化应激中的作用，研究人员在4-PBA干预后进行了进一步分析。KEGG富集分析显示，谷胱甘肽代谢通路被特异性富集，而钙信号、PI3K-Akt和MAPK等应激相关通路，以及炎症和细胞衰老相关通路仍然显著富集。GO结果表明，4-PBA处理后的差异表达基因主要富集于离子转运调控、分泌过程和神经元突触末端相关功能。这表明4-PBA可能通过调节氧化还原代谢和神经元分泌功能发挥神经保护作用。
综合这些发现表明，脑膜淋巴功能障碍在单纯CVST之外，加剧了内质网应激/氧化应激及相关凋亡信号通路的转录激活，在基因表达水平上揭示了一个加剧脑损伤的潜在机制。
脑膜淋巴管功能障碍导致内质网应激/氧化应激等自噬相关通路表达升高
研究人员通过多种方法验证了CVST小鼠脑膜淋巴功能障碍后ER应激/氧化应激通路的激活。RT-qPCR分析显示，CVST和CVST+结扎组中CHOP、PUMA、ATF4和Caspase-12的表达上调，提示脑组织中诱导了ER应激。免疫荧光染色进一步证实了这些ER应激标志物的上调。此外，RT-qPCR显示IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17和IL-10的表达升高，表明CVST触发了神经炎症，且结扎加剧了这种炎症。与对照组相比，CVST和CVST+结扎组均表现出GRP78、CHOP、Caspase-12、ATF4、p-eIF2α和PUMA的表达显著上调，表明两种条件均诱导了ER应激。值得注意的是，CVST+结扎组这些标志物的蛋白水平甚至高于CVST组，证明结扎加剧了CVST诱导的ER应激。此外，NLRP3和IL-1β表达的免疫荧光分析显示，结扎组小胶质细胞焦亡显著增加。
抑制内质网应激导致脑膜淋巴功能障碍后CVST中氧化应激相关通路表达降低
为了进一步验证淋巴功能障碍后ER应激/氧化应激通路的激活，研究人员使用了ER应激抑制剂4-PBA。RT-qPCR和免疫荧光分析表明，4-PBA处理显著减弱了CHOP、ATF4、PUMA和Caspase-12的表达。一致地，ELISA显示4-PBA显著降低了IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17和IL-10的水平。这些发现表明，用4-PBA抑制ER应激有效减轻了CVST+结扎诱导的神经炎症。此外，它们提示结扎通过加剧ER应激而加重CVST诱导的脑损伤。蛋白质印迹证实，4-PBA处理显著降低了GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α、PUMA、ATF4和Caspase-12的蛋白水平，证明4-PBA有效抑制了CVST+结扎触发的脑组织ER应激。
讨论
脑膜淋巴管（mLVs）的发现改变了神经免疫学的传统认知。这些血管对于清除代谢废物、循环脑脊液和维持中枢神经系统稳态至关重要。越来越多的证据表明，mLVs在各种神经系统疾病的发生和发展中起着重要作用。在本研究中，研究人员观察到mLVs功能障碍的CVST小鼠脑损伤显著加剧。同时，mLVs功能障碍后，ER应激和氧化应激的标志物显著上调。药理学抑制ER应激减轻了mLVs受损的CVST小鼠的脑损伤。综合这些发现表明，mLVs功能障碍通过涉及ER和氧化应激通路的联合机制加重了CVST诱导的脑损伤。
脑膜淋巴系统功能障碍可影响神经系统疾病的发展和进程。该系统在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病中起着关键作用。脑膜淋巴引流受损阻碍了β-淀粉样蛋白的清除，促进神经炎症和进行性神经元丢失，从而加剧阿尔茨海默病的病理。研究表明，用血管内皮生长因子C（VEGF-C）治疗可缓解这些症状。此外，一项研究深颈淋巴-静脉吻合术治疗阿尔茨海默病的临床试验就是基于恢复脑膜淋巴功能的理论。Zou等人证明，在A53T小鼠中结扎深颈淋巴结会加剧大脑中的α-突触核蛋白聚集。这一病理过程伴随着神经胶质增生、促炎细胞因子表达增加和tau蛋白水平升高。脑膜淋巴功能也影响神经系统的免疫介导和感染性疾病的结果。Louveau等人证明，改善脑膜淋巴功能可减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎患病小鼠的临床症状。Li等人观察到mLVs促进颅内病毒的清除，并在脑血管疾病和创伤性脑损伤的病理生理反应中起关键作用。Wang等人进一步发现，在脑室内出血的大鼠中，mLVs从脑室清除铁蛋白，从而减少无菌性炎症并减轻脑积水的发展。Yanev等人观察到，在动脉性卒中小鼠模型中，mLVs发育不全加剧了卒中后脑损伤的严重程度。类似地，Bolte等人证明脑膜淋巴功能受损会加重创伤性脑损伤。在本研究中，研究人员在CVST小鼠中结扎深颈淋巴结以进一步加重脑膜淋巴功能障碍。与未结扎的CVST小鼠相比，接受淋巴结结扎的小鼠表现出更明显的行为缺陷和更广泛的脑损伤，同时脑细胞凋亡和神经元损伤显著增加。与其他神经系统疾病中的观察结果一致，本研究的发现表明，脑膜淋巴功能受损会放大CVST后的脑损伤程度。
脑膜淋巴系统通过引流脑脊液和清除生理和病理状态下的代谢废物，在调节大脑内的神经炎症反应中起关键作用。这个过程深刻影响神经系统疾病的病理生理过程。mLV网络促进中枢免疫细胞如树突状细胞（DCs）、B淋巴细胞、T细胞和中性粒细胞进入外周免疫系统。这一过程诱导自身反应性T细胞反应并调节外周免疫。Louveau等人证明了DCs在mLV系统内的存在。将标记的DCs注入小脑延髓池后，他们观察到这些细胞通过mLV网络引流并参与中枢免疫反应。脑膜中的B淋巴细胞可以迁移到颈淋巴结并参与颅内免疫反应。小胶质细胞高表达趋化因子CCL21，它与免疫细胞表面的CCR7受体结合，介导T细胞从脑膜迁移到深颈淋巴结。Rustenhoven等人报道，对老年小鼠脑膜淋巴管内皮单核细胞的单细胞测序显示，由于T细胞积累，老年脑膜中干扰素-γ（IFN-γ）增加，这导致了脑损伤。同时，TNF-α和IL-1β等炎症刺激可以激活脑膜淋巴管内皮细胞中的NF-κB信号通路，诱导粘附分子的表达，包括细胞间粘附分子-1和血管细胞粘附分子-1，从而促进免疫细胞募集和跨膜迁移。本研究的结果表明，脑膜淋巴功能障碍后，CVST小鼠表现出显著增加的脑细胞凋亡，同时IBA1和CD68的表达显著升高。在此阶段，CVST小鼠表现出升高的促炎水平，表明脑膜淋巴系统通过调节炎症反应影响CVST小鼠的脑损伤。
CVST阻碍脑静脉流出，升高颅内压，并损害细胞外液的引流。由此导致的脑实质内液体积聚引起脑水肿。同时，血脑屏障的破坏触发炎症反应。这三个基本的病理过程形成恶性循环，放大了脑组织损伤。炎症和免疫机制在CVST的发病机制中起关键作用，并强烈影响其临床预后。Jin等人观察到中性粒细胞胞外诱捕网参与自噬并促进CVST患者的血栓形成。小胶质细胞、星形胶质细胞和中性粒细胞等炎症细胞有助于CVST后脑损伤的病理生理学。Ding等人证明抑制cGAS-STING轴可减少CVST小鼠的炎症小体激活和小胶质细胞焦亡，从而减轻脑损伤。在另一项研究中，Ding等人使用RNA测序分析了CVST后大脑皮层的转录改变，并观察到炎症反应通路的显著增加。通过对这些转录组数据的分析，研究人员发现与ER应激、氧化应激和炎症相关的通路在CVST状态下被显著激活。ER和氧化应激通路的激活是CVST诱导脑损伤的关键神经炎症机制。
为了研究CVST小鼠脑膜淋巴功能障碍中内质网（ER）和氧化应激通路的改变，研究人员分析了它们的转录组水平。KEGG通路富集分析显示，与氧化应激相关的AGE-RAGE信号通路在整个疾病过程中持续激活。同时，核心抗氧化防御通路（FoxO信号）在CVST和CVST+结扎组中被特异性诱导。然而，在用ER应激抑制剂4-PBA治疗后，该通路的富集消失，取而代之的是谷胱甘肽代谢通路的显著激活。此外，作为ER应激和氧化应激之间关键桥梁的钙信号通路在两个比较组中均高度富集。GO富集分析显示，差异表达基因显著富集于与轴突结构、离子通道功能、神经肽分泌和认知相关的通路。这些通路与维持神经元稳态密切相关，它们的失调是ER和氧化应激的经典下游事件。此外，分泌相关通路的表达谱在ER应激抑制剂4-PBA治疗后表现出显著逆转，提示ER应激在该模型的神经元损伤中起关键作用。综上所述，这些数据表明CVST合并结扎处理诱导了显著的ER应激，导致钙稳态破坏并驱动氧化应激。相反，4-PBA减轻了ER应激，从而恢复了细胞的氧化还原平衡。因此，脑膜淋巴功能障碍可能涉及炎症和细胞因子介导的信号调控，并与内质网应激和凋亡过程相关。
氧化应激通过过量产生活性氧来激活炎症小体，特别是NLRP3。炎症小体，包括NLRP3，作为多蛋白受体，促进IL-1β和IL-18的成熟并诱导焦亡，从而参与炎症反应和免疫调节。ER应激指的是细胞对内质网内错误折叠或未折叠蛋白超过其折叠能力的反应。氧化应激和ER应激密切互动，彼此都能引发对方。本研究转录组学分析表明，脑膜淋巴功能障碍可能破坏了这种平衡，从而维持和放大了一个恶性循环，最终导致更严重的神经元凋亡和神经炎症。因此，利用蛋白质印迹、聚合酶链反应和免疫荧光等分子生物学技术，研究人员检测了CVST组和淋巴结扎组中与ER应激和氧化应激相关的通路。研究人员观察到淋巴功能障碍后ER和氧化应激标志物显著升高。随后用4-苯基丁酸抑制ER应激有效逆转了这些异常的分子改变。这些结果证明，脑膜淋巴功能障碍后ER和氧化应激通路的上调加剧了CVST小鼠的脑损伤，并进一步支持了研究的核心假设。内质网（ER）应激主要由PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路驱动。在ER应激介导的凋亡过程中，CHOP、p-IRE1α、p-PERK和caspase-12等关键标志物在早期阶段显著上调，随后诱导或修饰TXNIP表达，这种变化与神经功能改变和脑损伤密切相关。相比之下，尽管IRE1α或ATF6的磷酸化/切割也有所增加，但它们的峰值表达出现较晚（≥48小时），并且特异性抑制这些分支并未显著影响急性期梗死体积，提示它们更多地参与延迟修复或慢性炎症。因此，本研究侧重于检测PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路的关键指标。结果显示，这些指标在建模后第二天显著升高，与之前的发现一致。在脑膜淋巴功能障碍的CVST小鼠中，这些通路标志物的上调更为明显，表明这种功能障碍可能通过调节该通路加剧脑损伤。此外，使用4-PBA抑制ER应激有效逆转了这些分子标志物的异常变化。这些结果表明，脑膜淋巴功能障碍增强了ER应激/氧化应激通路的激活，从而加重了CVST小鼠的脑损伤。
本研究存在一定的局限性。首先，结扎深颈淋巴结模拟脑膜淋巴功能障碍并不能完全复制人类CVST病例中观察到的复杂淋巴引流改变；此外，结扎过程本身可能诱导局部炎症，从而引入潜在的混杂效应。其次，研究主要关注CVST相关淋巴功能障碍后的核心ER和氧化应激通路，并未充分探索与其他关键通路（如自噬和其他细胞死亡程序）的精确相互作用。此外，需要指出的是，本研究仅使用了雄性小鼠。未来的研究应探讨性别差异对mLV功能和CVST预后的影响。
在未来的研究中，可以考虑采用条件性基因敲除小鼠（例如淋巴管内皮细胞中特异性缺失关键基因的小鼠）或VEGF-C介导的淋巴管特异性增生模型，以更精确地调控脑膜淋巴功能。这些方法将能够验证所涉及的机制，并阐明脑膜淋巴管、氧化应激、NLRP3炎症小体激活和焦亡之间的上下游分子联系。最终，这些研究将加强针对CVST中脑膜淋巴功能的新治疗方法的机制理论基础。
结论
脑膜淋巴系统功能障碍是CVST后脑损伤加剧的一个关键因素。本研究的实验结果表明，淋巴引流受损显著恶化神经功能缺损，并放大脑组织病理学、炎症反应和细胞凋亡。此外，研究人员确定了ER和氧化应激通路是这种加剧的脑损伤的关键介质。这些发现为旨在保护或增强脑膜淋巴功能以减轻CVST相关脑损伤的新治疗方法提供了关键的理论和实验支持。
