《Frontiers in Molecular Biosciences》：Identification of CXCL12 as a key gene of trophoblast and endometrial stromal cell decidualization in pregnancy via scRNA-seq and experimental validation
编辑推荐：
本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，首次在复发性流产（RM）背景下系统描绘了母胎界面的单细胞图谱，发现滋养层细胞中CXCL12表达显著下调。功能实验证实CXCL12通过其受体CXCR4促进滋养细胞（HTR-8/SVneo）的增殖、迁移和侵袭，并驱动子宫内膜基质细胞（ESCs）的蜕膜化过程。研究揭示了CXCL12/CXCR4轴功能下调参与RM发病的新机制，为相关诊断和治疗策略提供了实验依据。
单细胞图谱揭示母胎界面细胞组成
研究伊始，团队利用10x Genomics技术对5例正常早孕女性和3例复发性流产（RM）患者的母胎界面（包括蜕膜和绒毛组织）样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。经过严格的质量控制，最终纳入了112,528个高质量细胞进行深入解析。通过Seurat软件包进行无监督的图聚类分析，成功鉴定出11种主要的细胞类型，其中包括关键的蜕膜基质细胞（DSCs）和合体滋养层/绒毛外滋养层细胞（SCT/EVT）。UMAP降维可视化清晰地展示了这些细胞簇的分布，为后续的差异分析奠定了基础。
CXCL12表达下调与功能富集分析
基于CXCL12在早期妊娠中的已知重要作用，研究者将目光聚焦于SCT/EVT细胞亚群。比较分析显示，与正常妊娠相比，RM病例的SCT/EVT细胞中CXCL12的表达量显著降低。为了探究CXCL12表达水平差异背后的生物学意义，研究人员根据CXCL12的表达中位数，将SCT/EVT细胞分为高表达组和低表达组，并进行了差异表达基因（DEGs）筛选，共鉴定出7532个与CXCL12相关的DEGs。基因本体（GO）富集分析表明，这些差异基因主要富集在姐妹染色单体分离、钙粘蛋白结合、泛素蛋白连接酶结合等生物学过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析则提示，这些基因显著富集于细胞周期、内质网中的蛋白质加工以及核质运输等信号通路。这些通路与细胞的增殖、迁移和侵袭能力密切相关，暗示了CXCL12可能通过调控这些关键过程影响妊娠结局。
CXCL12过表达促进滋养细胞生长与运动
为了在功能层面验证CXCL12的作用，研究团队在人类绒毛膜滋养细胞系HTR-8/SVneo中构建了CXCL12的过表达模型。Western blotting结果确认了转染CXCL12 cDNA后，细胞中CXCL12蛋白水平显著升高。MTT法检测细胞活性表明，过表达CXCL12显著促进了HTR-8细胞的增殖能力。进一步的细胞划痕实验显示，CXCL12过表达组的细胞在24小时后的迁移率明显高于空载体对照组，表明其水平迁移能力增强。Transwell基质胶侵袭实验的结果更为直观：过表达CXCL12的HTR-8细胞穿透基质胶的能力显著提升，侵袭细胞数量大幅增加。这些结果综合证实，CXCL12能够有效增强滋养细胞的增殖、迁移和侵袭活性。
CXCL12基因沉默抑制滋养细胞功能
作为反向验证，研究通过小干扰RNA（siRNA）技术在HTR-8细胞中敲低了CXCL12的表达。Western blotting证实了敲低效率。与过表达实验的结果相反，MTT检测发现CXCL12沉默后，HTR-8细胞的增殖活力受到明显抑制。细胞划痕实验显示，沉默组的细胞迁移速率显著减慢。同样，Transwell侵袭实验也观察到，CXCL12敲低后，能够侵袭穿过小室的细胞数量急剧减少。这一正一反两组实验，有力地证明了CXCL12对于维持滋养细胞正常的生物学功能是必不可少的。
CXCL12促进子宫内膜基质细胞蜕膜化
研究的另一重要部分是探讨CXCL12对子宫内膜基质细胞（ESCs）蜕膜化的影响。研究人员使用重组人CXCL12蛋白刺激ESCs，并设立了阴性对照（无刺激）、阳性对照（使用0.05 mM 8-bromo-cAMP和1 μM 甲羟孕酮MPA刺激）以及CXCL12刺激同时添加CXCR4中和抗体等实验组。在刺激培养第四天，显微镜下可以观察到，与阴性对照组相比，CXCL12刺激组的ESCs形态由长梭形的成纤维细胞样转变为卵圆形或圆形，呈现出典型的蜕膜化细胞形态特征。为了定量评估蜕膜化程度，研究人员检测了蜕膜化标志物胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP-1）的蛋白表达水平。Western blotting结果显示，CXCL12刺激组中IGFBP-1的表达量显著高于阴性对照组，甚至与化学诱导的阳性对照组效果相当。而当在CXCL12刺激的同时加入CXCR4中和抗体后，IGFBP-1的表达水平出现了显著回落，虽然仍高于阴性对照。这表明CXCL12对ESC蜕膜化的促进作用至少部分是依赖于CXCR4受体介导的信号通路。
讨论与展望
本研究整合了生物信息学分析与体外功能实验，从单细胞分辨率层面揭示了CXCL12在正常妊娠和复发性流产（RM）中的表达差异和潜在功能。研究发现RM患者滋养细胞中CXCL12的低表达可能通过影响细胞周期、粘附等关键通路，进而损害滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时，CXCL12还能以CXCR4依赖的方式促进子宫内膜基质细胞的蜕膜化。CXCL12/CXCR4轴的功能下调，可能从滋养细胞功能异常和子宫内膜容受性建立受损两个方面共同导致了RM的发生。
当然，本研究也存在一些局限性，例如单细胞测序样本量相对较小，人群来源单一；缺乏与详细临床参数的关联分析；体外模型无法完全模拟体内复杂的微环境；CXCL12促进蜕膜化的精确下游信号机制尚未完全阐明，可能存在CXCR7（ACKR3）等其他受体的参与，以及PI3K/AKT、MAPK/ERK等信号通路的激活。未来的研究需要在更大规模临床队列、动物模型以及更深入的分子机制层面进行验证和探索。
尽管存在这些局限，本研究的结果无疑强调了CXCL12在维持正常妊娠中的关键作用。CXCL12不仅直接调控滋养细胞的生理功能，还积极参与子宫内膜的蜕膜化准备，其表达异常可能是RM的一个重要因素。因此，CXCL12及其信号通路成为未来探索流产防治新靶点的一个极具潜力的方向。
