桑树盐过度敏感3蛋白（MnSOS3）通过调控SOS信号通路及离子稳态赋予耐盐性的功能分析

《Frontiers in Plant Science》：Analysis of salt resistance conferred by salt overly sensitive 3 protein from mulberry (Morus notabilis)

这篇研究性论文（非综述）系统阐明了桑树（Morus notabilis）盐过度敏感3蛋白（MnSOS3）在盐胁迫应答中的关键作用。研究通过原核表达、转基因烟草（Nicotiana benthamiana）功能验证及酵母双杂交等技术，证实MnSOS3通过与其互作蛋白MnSOS2形成复合物，激活SOS（Salt Overly Sensitive）信号通路，进而调控Na+/H+逆向转运蛋白（SOS1）等下游效应器，促进Na+外排和K+保持，显著降低叶片Na+/K+比，从而增强植物的耐盐性。该研究为桑树及林木作物的耐盐育种提供了重要的基因资源（MnSOS3）。

　　

1 引言

土壤盐渍化严重威胁作物生产力和农业可持续性。桑树（Morus notabilis）作为一种重要的经济林木，其耐盐分子机制尚不明确。盐过度敏感（Salt Overly Sensitive, SOS）信号通路是植物中研究最为深入的耐盐机制之一，其核心组分SOS3是一种钙调神经磷酸酶B类似（CBL）蛋白，在盐胁迫下的离子稳态调节中起关键作用。本研究旨在克隆桑树SOS3同源基因（MnSOS3），并深入探究其在耐盐性中的功能及分子机制。

2 材料与方法

研究使用2月龄桑树幼苗，从其cDNA中克隆获得MnSOS3编码序列。通过序列比对和系统进化分析其保守结构域。构建pCold-TF-MnSOS3原核表达载体转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21，评估其在含不同浓度NaCl培养基中的生长情况。同时，通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的叶盘法将MnSOS3基因导入本氏烟草（Nicotiana benthamiana），获得11个独立的过表达株系。对转基因烟草进行不同浓度（100, 200, 300 mM）NaCl胁迫处理，观察表型并计算存活率。使用火焰光度计测定叶片和根部的Na⁺、K⁺含量。通过酵母双杂交（Yeast two-hybrid, Y2H）实验验证MnSOS3与MnSOS2蛋白之间的相互作用。

3 结果

3.1 MnSOS3的克隆与序列分析

MnSOS3基因开放阅读框（ORF）长642 bp，编码213个氨基酸，预测分子量为24.5 kDa，等电点（pI）为4.80。其蛋白序列包含典型的EF-hand钙结合结构域和N端豆蔻酰化修饰位点（MGCFSSK）。与拟南芥AtSOS3的氨基酸序列一致性达72%。系统进化分析显示，MnSOS3与花生（Arachis hypogaea）AhSOS3亲缘关系最近。

3.2 MnSOS3在非生物胁迫下的表达模式

qRT-PCR分析表明，在250 mM NaCl盐胁迫下，MnSOS3表达量显著上调，在24小时达到峰值，为对照的8.3倍。在10% PEG6000模拟的干旱胁迫下，其表达在8小时略有下降后持续诱导，于48小时达到最高（为对照的8.1倍），表明MnSOS3参与多种逆境胁迫响应。

3.3 MnSOS3的原核表达及其在大肠杆菌中赋予的耐盐性

SDS-PAGE证实成功表达约90 kDa的pCold-TF-MnSOS3融合蛋白。在0.6 M NaCl的高盐胁迫下，含空载体的对照大肠杆菌生长受到严重抑制，而表达MnSOS3的重组菌株则能持续生长，最大OD₆₀₀达到0.338，显著高于对照。

3.4 转基因烟草的分子鉴定

PCR和GUS染色证实MnSOS3成功整合到烟草基因组中。qRT-PCR显示不同转基因株系中MnSOS3表达水平存在差异，其中MnSOS3-2株系表达量最高。

3.5 转基因烟草的耐盐性

在300 mM NaCl胁迫处理7天后，过表达MnSOS3的转基因烟草株系（如MnSOS3-2）的存活率为33.3% ± 4.7%，显著高于野生型（Wild-Type, WT）的13.3% ± 4.7%。在较低浓度盐胁迫下（100, 200 mM），转基因植株也表现出更轻的萎蔫和黄化症状。

3.6 盐胁迫下转基因烟草的离子稳态

在250 mM NaCl胁迫下，转基因烟草（MnSOS3-2）叶片中的Na⁺含量（0.95 ± 0.02 mmol/g FW）比WT（2.10 ± 0.07 mmol/g FW）显著降低54.8%，而K⁺含量（1.75 ± 0.02 mmol/g FW）则比WT（1.20 ± 0.02 mmol/g FW）显著增加45.8%，导致叶片Na⁺/K⁺比值降低67.8%（转基因: 0.55 ± 0.01 vs WT: 1.71 ± 0.08）。尽管转基因植株根部积累了更多Na⁺，但其K⁺水平与WT相当，根部Na⁺/K⁺比无显著差异，表明MnSOS3可能通过调节离子分布，将Na⁺更多地截留在根部以保护叶片。

3.7 MnSOS3与MnSOS2在酵母中的相互作用

酵母双杂交实验证实，共转化pGBKT7-MnSOS3（诱饵）和pGADT7-MnSOS2（猎物）质粒的酵母细胞能在 stringent 选择性培养基（TDO/X, QDO/X）上生长并产生蓝色菌落，而阴性对照不能，明确证明了MnSOS3与MnSOS2之间存在特异的蛋白-蛋白相互作用。

4 讨论

本研究结果表明，MnSOS3是一个功能保守的SOS通路组分。其在盐胁迫下的快速诱导表达、与MnSOS2的物理互作、以及过表达后显著改善的离子稳态（降低Na⁺/K⁺比）和耐盐表型，共同支持了其通过激活SOS信号通路发挥功能的模型。该通路可能涉及：盐胁迫引发胞质Ca²⁺信号；Ca²⁺与MnSOS3的EF-hand结构域结合，使其构象变化；活化的MnSOS3与MnSOS2激酶互作形成功能复合体；该复合体进一步磷酸化并激活质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（如SOS1），促进Na⁺外排，同时可能调节液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（如NHX1）进行Na⁺区隔化，并维持K⁺稳态。MnSOS3中独特的豆蔻酰化位点（MGCFSSK）可能影响其膜定位和功能，值得进一步研究。本研究为利用MnSOS3基因进行桑树等作物的耐盐性遗传改良奠定了理论基础。

5 结论

本研究成功从桑树中克隆了MnSOS3基因，并证实其过表达能通过激活SOS信号通路、调节离子稳态（促进Na⁺外排/区隔、维持K⁺水平）来显著增强植物的耐盐性。MnSOS3与MnSOS2的相互作用是该机制的核心环节。这些发现深化了对桑树耐盐机制的理解，并为耐盐桑树品种的选育提供了关键的基因资源（MnSOS3）。