靶向高影响突变谱的广谱SARS-CoV-2 RBD疫苗与新型佐剂HP007联用可诱导持久T细胞应答并为小鼠提供广泛保护

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：A broad-spectrum SARS-CoV-2 RBD vaccine with selected high-impact mutations and novel adjuvant induces durable T cell response and broad protection in mice

本研究报道了一种新型广谱SARS-CoV-2疫苗策略：通过理性设计整合关键高影响突变位点（K417T、L452R、T478K、E484K、N501Y）的受体结合域（RBD）抗原M5-RBD，与新型CpG佐剂HP007及Al(OH)3联用。该疫苗在小鼠模型中成功诱导了高效、持久的广谱中和抗体（nAb）和T细胞免疫应答，并对包括奥密克戎（Omicron）多种亚系在内的变异株及野生型病毒的攻击提供了显著保护，为应对新冠病毒持续变异、开发下一代广谱COVID-19疫苗提供了有前景的候选方案。

　　

引言

自疫情爆发以来，SARS-CoV-2持续变异，其刺突（Spike）蛋白的受体结合域（RBD）因高度变异而导致的免疫逃逸是当前疫苗面临的主要挑战。世界卫生组织（WHO）认定的关切变异株（VOC），如阿尔法（Alpha）、贝塔（Beta）、伽马（Gamma）、德尔塔（Delta）和奥密克戎（Omicron）及其众多亚系，均表现出增强的传播力或免疫逃逸能力，削弱了现有疫苗的保护效果。RBD是中和抗体的主要靶标，因此，开发基于RBD的广谱疫苗至关重要。此外，佐剂对于增强重组蛋白疫苗的免疫原性和持久性不可或缺。

筛选高影响突变RBD抗原

研究首先通过生物信息学分析筛选对ACE2结合和抗体逃逸有显著影响的RBD突变位点。SimPlot分析显示，RBD是SARS-CoV-2基因组中变异最大的区域。对大量RBD突变数据的标准化（Z-score）和相关性分析发现，大多数突变对ACE2结合和免疫逃逸影响甚微（低影响突变），而少数位点如K417、L452、E484、N501等则产生显著影响（高影响突变）。基于此，研究提出了“平衡变异性与保守性”的抗原设计原则，构建了包含不同组合突变（M3, M4, M4T等）的RBD-Fc二聚体抗原，并在293F细胞中成功表达纯化。

M5-RBD诱导针对SARS-CoV-2变异株的广泛体液免疫

在BALB/c小鼠模型中评估了不同突变抗原的免疫原性。与野生型RBD（WT-RBD）相比，整合了K417T、L452R、T478K、E484K和N501Y这五个关键突变的M5-RBD抗原，在两次免疫后诱导了最高效的广谱中和抗体，其对奥密克戎BA.1和BA.2的中和抗体几何平均滴度（GMT）分别提升了28.3倍和46.3倍。值得注意的是，引入额外的低影响突变位点（如N440K或G446S）形成的M6K-RBD和M6S-RBD，其免疫效果反而不及M5-RBD，验证了精准筛选高影响突变位点的策略。M5-RBD免疫小鼠的血清对后续出现的BA.2.75、BA.5、BF.7、BQ.1.1、XBB、EG.5、JN.1、KP.3等多种奥密克戎亚系也表现出强效交叉中和活性。活病毒中和试验（PRNT₅₀）结果与假病毒中和试验一致。抗原图谱分析进一步显示，M5-RBD免疫血清与多种变异株之间的抗原距离显著缩短，表明其诱导的抗体应答谱更广。

HP007在小鼠中引发广泛且持久的体液和细胞免疫

研究评估了新型CpG佐剂HP007的效果。体外实验表明，HP007能有效激活小鼠TLR9（mTLR9）通路，且活性优于已上市的CpG 1018。在小鼠免疫实验中，M5-RBD抗原与HP007及Al(OH)₃联用，诱导的IgG和中和抗体滴度最高，并能有效激发Th1型免疫反应，表现为高水平的IgG2a抗体和细胞因子（如IFN-γ、TNF）的产生。重要的是，该疫苗方案诱导的T细胞应答具有持久性，在初次免疫四个月后，小鼠脾细胞在WT、奥密克戎BA.2和BA.5的RBD蛋白刺激下，仍能产生显著的IFN-γ和TNF，并激活大量IFN-γ⁺CD4⁺和 IFN-γ⁺CD8⁺T细胞，尤其是针对奥密克戎BA.2的应答最为强烈。

M5-RBD佐剂化后对SARS-CoV-2野生型和奥密克戎攻击提供完全保护

在致命的K18-hACE2转基因小鼠攻毒模型中，三剂免疫M5-RBD加HP007和Al(OH)₃的疫苗，能完全保护小鼠免受致死剂量的SARS-CoV-2野生型（250 PFU）和奥密克戎BA.2（5000 PFU）毒株的攻击。与PBS对照组相比，免疫组小鼠体重无显著下降，全部存活。疫苗显著降低了病毒在肺、鼻甲和脑组织中的复制水平（病毒RNA拷贝数降低可达数log₁₀），并在感染后期使病毒载量降至检测限以下。组织病理学分析显示，免疫组小鼠的肺和鼻甲组织病理损伤显著减轻，仅见轻微病变，并在感染后期基本恢复正常，而对照组则出现严重的间质性肺炎、肺泡壁增厚、出血及上皮细胞脱落等病变。在温和的BALB/c小鼠感染模型中，M5-RBD也显示出比WT-RBD更优的上呼吸道病毒清除能力。

讨论

本研究证实，基于理性设计、整合关键高影响突变位点的M5-RBD抗原，能够有效克服SARS-CoV-2变异株的免疫逃逸，诱导产生广谱的中和抗体。新型CpG佐剂HP007与Al(OH)₃联用，则进一步增强了疫苗的免疫原性，诱发了强大且持久的体液和细胞免疫，从而在动物模型中提供了针对多种变异株的广泛保护。该策略为开发下一代广谱COVID-19疫苗提供了重要参考。研究的局限性在于未在具有预存免疫力（如先前感染或接种过疫苗）的模型中进行评估，且最佳免疫程序（如剂次和间隔）有待进一步探索。尽管如此，M5-RBD与HP007的组合展现出了巨大的应用潜力。