《Frontiers in Immunology》：Broad and robust T cell immunity compensates the population immune barrier against antibody-escaping Omicron variants
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本综述深入探讨了SARS-CoV-2奥密克戎（Omicron）变异株特异性抗体逃逸与稳定交叉反应性T细胞应答之间的补偿机制。研究通过评估BF.7/BA.5.2、XBB和JN.1康复者队列以及四价重组蛋白疫苗（含Alpha、Beta、Delta和Omicron BA.1变异株三聚体刺突蛋白）接种者的免疫动态，揭示了尽管中和抗体（NAbs）存在快速衰减和变异株特异性逃逸（如BA.3.2显示出最强的免疫逃逸），但T细胞免疫（包括CD4+和CD8+T细胞）表现出显著的持久性和广谱交叉反应性。抗原图谱（Antigenic Cartography）分析量化了变异株间的抗原关系。研究强调，在病毒持续进化的背景下，刺激强大的T细胞免疫对于建立针对未来冠状病毒/变异株的高水平人群免疫屏障至关重要，为优化疫苗策略和免疫监测系统提供了科学依据。
引言
自2019年底爆发以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）不断发生突变和进化，产生了具有增强传播力和免疫逃逸能力的多种变异株。病毒进化从早期的关切变异株（例如Delta）发展到全球主导的奥密克戎（Omicron）变异株，包括BA.1、BA.2、BA.4/5、BF.7、XBB和BA.2.86/JN.1，形成了一个复杂的进化格局，对全球公共卫生持续构成挑战。目前，JN.1的后代变异株仍在全球占主导地位，包括KP.3系列、重组变异株XEC以及快速传播的新兴变异株如NB.1.8.1、LP.8.1系列和XFG。值得注意的是，BA.3.2作为一个高度分化的变异株，相对于BA.3携带超过50个突变，其刺突（S）蛋白发生了独特的构象变化，尽管全球传播有限，但显著增强了免疫逃逸能力。此类抗原性明显不同的变异株的不断出现，凸显了SARS-CoV-2进化的动态性以及进行全面免疫监测的必要性。
了解对这些进化中变异株的免疫反应对于大流行管理至关重要。血清中和抗体（NAbs）是抵御SARS-CoV-2感染的重要免疫防线，但其水平在感染或疫苗接种后数月内迅速下降。SARS-CoV-2中和抗体在康复后6-8个月表现出显著衰减。尽管重症患者最初产生较高的抗体滴度，但其衰减动力学与轻症病例观察到的结果相似。疫苗接种诱导的中和抗体也表现出类似的时间依赖性减弱，在各种疫苗平台（包括灭活疫苗、mRNA疫苗和腺病毒载体疫苗）中，3-6个月内均观察到显著下降。关键的是，新兴变异株表现出越来越强的中和抗体逃逸能力。研究表明，针对BQ.1.1和XBB.1变异株的中和抗体滴度分别比针对BA.5的滴度低3-8倍和8-21倍。BA.2.86和JN.1谱系变异株与早期Omicron变异株（如XBB.1.5）相比，中和抗体滴度降低了2-5倍，并对大多数治疗性单克隆抗体表现出广泛的耐药性。新兴变异株广泛的体液免疫逃逸显著削弱了基于中和抗体的保护作用，导致即使在高度接种疫苗的人群中也发生突破性感染和再感染。
相反，T细胞免疫针对SARS-CoV-2提供了比体液反应更持久和广谱的保护。研究一致表明，病毒特异性T细胞对变异株的交叉反应性得到了很好的保留。在COVID-19康复者中，70-90%的CD4+和CD8+T细胞对各种Omicron变异株（包括高度突变的BA.2.86和JN.1变异株）保持反应性。这种交叉反应性源于T细胞表位的多样性和保守性，这些表位识别多种病毒蛋白，包括S蛋白、核衣壳（N）蛋白和膜（M）蛋白，从而限制了单个突变的影响。对SARS康复者的纵向研究显示，SARS-CoV特异性T细胞在感染后数年仍可检测到，并对SARS-CoV-2表现出强烈的交叉反应性。此外，尽管SARS-CoV-2康复者在康复12个月后中和抗体显著下降，但特异性T细胞反应持续强劲，并对Alpha、Beta、Gamma和Delta变异株表现出交叉反应性。这种长期的T细胞记忆为抵御新型变异株提供了关键保护。有证据表明，尽管中和抗体无效，但T细胞交叉反应性提供了关键保护。流行病学数据表明，尽管由于不断出现的新变异株导致感染率上升，但针对再感染引起的严重疾病和死亡的保护仍然很高，这主要归因于持续的T细胞免疫。这些发现强调了将T细胞反应纳入人群免疫力和疫苗有效性评估的重要性。
自2022年底以来，SARS-CoV-2的流行株经历了Omicron谱系变异株的独特更替模式，从BF.7/BA.5.2到XBB，再到JN.1。这种独特的流行病学轨迹为检验不同暴露史下的免疫特征提供了一个特殊的机会。然而，在此背景下，对体液和细胞免疫反应动态、广度和持久性的系统评估仍然有限。鉴于病毒的持续进化和变异株的不断出现，全面研究变异株特异性的免疫影响具有重大的科学和临床重要性。我们假设，尽管存在变异株特异性的抗体衰减，但T细胞免疫保持更广泛的交叉反应性，从而建立了一个补偿性的人群免疫屏障。本研究旨在阐明SARS-CoV-2感染和疫苗接种过程中的体液-细胞免疫相互作用。
材料与方法
研究设计与参与者
在2022年12月至2024年8月期间招募了四个不同的参与者队列。BF.7/BA.5.2康复者队列包括2022年12月至2023年1月期间在北京从SARS-CoV-2感染中康复的成年人。血液样本在康复后14-28天和康复后6个月收集。XBB康复者队列包括2023年6月至7月期间感染XBB谱系变异株并康复的个体。血液样本在康复后7天和14-28天收集。JN.1康复者队列包括2024年4月至8月期间感染JN.1变异株的个体，血液样本在康复后14-28天收集。疫苗接种队列包括接种重组蛋白疫苗（一种四价COVID-19疫苗，含有来自SARS-CoV-2 Alpha、Beta、Delta和Omicron BA.1变异株的三聚体刺突蛋白）的人员，血液样本在基线（第0天）和接种后21天收集。本研究在连续的流行高峰期采用便利抽样，样本量符合既定的COVID-19探索性免疫学研究实践。
所有SARS-CoV-2感染均通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）或咽拭子抗原检测确认。感染毒株是根据传播高峰期当地流行病学监测数据确定的，当时特定变异株已占据明显主导地位（> 90%流行率）。所有参与者报告在最近一次SARS-CoV-2感染前3个月内无呼吸道症状。研究方案获得了中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所伦理委员会的批准。所有参与者均提供了书面知情同意书。
样本收集与处理
在预定时间点收集外周静脉血样本。用于制备血清的样本在室温下凝固30分钟，然后以3,000 rpm离心15分钟。血清分装后于-80°C保存直至检测。用于分离外周血单核细胞（PBMCs）的样本采集于肝素化试管中，并在采集后4小时内处理。使用Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs。血液样本稀释后小心地铺在Ficoll-Paque淋巴细胞分离液上，然后在室温下以800 g离心30分钟（加速/减速设置为3/1）。收集血浆-介质界面的PBMC层，用RPMI 1640培养基洗涤1-2次（1,500 rpm，10分钟），重悬并计数。新鲜PBMCs立即用于T细胞检测，或使用含有10%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）在液氮中冷冻保存。
表达质粒构建
为关键变异株构建了刺突蛋白表达质粒，包括原型株（祖先毒株，参考Wuhan-Hu-1）、BF.7、XBB.1.5、JN.1、KP.3、XEC、NB.1.8.1、LP.8.1.1和BA.3.2。基于变异株特异性序列设计密码子优化的刺突蛋白胞外域序列，并在C末端融合T4纤维蛋白三聚化结构域以增强蛋白质稳定性。通过定点诱变引入每个变异株的特征性突变，并通过DNA测序验证所有构建体。刺突蛋白表达载体使用含有CMV启动子、多克隆位点和SV40 poly-A信号的哺乳动物细胞表达系统。在N端或C端加入适当的标签序列，以方便下游纯化和检测。
VSV假病毒生产
使用水疱性口炎病毒（VSV）假型系统生成假病毒。将HEK-293T细胞接种于10 cm培养皿中，待融合度达到70-80%时，使用脂质体转染试剂转染相应的刺突蛋白表达质粒。转染24小时后，以3-5的感染复数（MOI）感染G蛋白缺陷型VSV（VSV-ΔG-GFP）。感染2小时后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）广泛洗涤细胞以去除残留的接种物。然后将培养基更换为含有10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），并加入抗VSV-G抗体至终浓度10 μg/mL。24小时后，收集上清液，通过0.45 μm滤膜过滤去除细胞碎片，分装后于-80°C保存。假病毒滴度使用Vero E6-ACE2细胞测定。通过荧光显微镜计数感染细胞来量化感染单位，滴度以每毫升转导单位（TU）表示。
假病毒中和试验
假病毒中和试验按照既定方案进行。血清样本在56°C加热30分钟以灭活补体，然后从1:20开始进行2倍系列稀释。等体积的稀释血清与标准化假病毒（约1,000 TU）在96孔板中混合，并在37°C、5% CO2条件下孵育1小时，以使抗体与病毒结合。随后，将100 μL血清-病毒混合物转移至预先铺有Vero E6-ACE2细胞的96孔板中。培养约15小时后，使用CQ1共聚焦成像细胞仪量化TU。通过四参数逻辑回归分析拟合剂量反应曲线，计算50%假病毒中和滴度（pVNT50）。pVNT50值低于检测阈值（< 20）的样本被归类为血清阴性，并赋值10用于计算几何平均滴度（GMT）。免疫逃逸倍数变化计算为参考毒株（通常是同源感染毒株）pVNT50与目标毒株pVNT50的比值。
肽池合成与体外PBMC培养
基于变异株特异性刺突蛋白序列合成了覆盖S1（101个肽）和RBD（30个肽）区域的重叠肽池。肽段长度为15-18个氨基酸，有10个氨基酸重叠，并根据不同Omicron变异株相对于原型序列的突变模式进行调整。肽纯度超过95%。将肽溶于DMSO制备20 mg/mL储备溶液，并在使用前用培养基稀释至工作浓度。康复者PBMCs使用与其感染变异株对应的S1肽池培养9天，即BF.7/BA.5.2康复者用BF.7/BA.5.2-S1肽池，XBB康复者用XBB-S1肽池，疫苗受试者用BA.5.2-S1肽池（反映疫苗的早期Omicron成分）。随后，使用培养的细胞检测针对代表性变异株（包括同源毒株）的S1和RBD肽池的特异性T细胞。
ELISpot试验
使用IFN-γ ELISpot试剂盒评估抗原特异性T细胞反应。预处理过的96孔ELISpot板在4°C下包被抗人IFN-γ单克隆抗体过夜。PBS洗涤后，用含有10% FBS的RPMI 1640完全培养基封闭。将培养的PBMCs（每孔105个细胞）接种到预包被的板中，并加入相应的肽池（终浓度2 μg/mL）。设立阴性对照（仅培养基）、阳性对照（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，PMA，5 μg/mL）和变异株肽池刺激组。在37°C、5% CO2条件下孵育18-24小时后，弃去细胞并用水-吐温溶液洗涤板。加入生物素化检测抗体，室温孵育2小时。PBS-吐温洗涤后，加入链霉亲和素，室温孵育1小时。使用底物溶液进行显色，并用去离子水终止反应。板干燥后，使用ELISpot读数仪计数斑点。结果以每百万PBMCs的斑点形成细胞数（SFCs/106PBMCs）表示。
细胞内细胞因子染色（ICS）
将PBMCs调整至1×106cells/mL，在37°C、5% CO2条件下用相应肽池（2 μg/mL）刺激1小时。然后加入蛋白质运输抑制剂布雷菲德菌素A（10 μg/mL）和莫能菌素（2 μM），继续孵育9-12小时。刺激后，收集细胞并用Live/Dead APC-Cy7染料染色以评估活力。使用抗CD3-FITC、抗CD4-PerCP-Cy5.5和抗CD8-BV510抗体在4°C下进行表面染色30分钟。然后固定和透化细胞，接着用抗IFN-γ-PE-Cy7、抗TNF-α-PE和抗IL-2-APC在4°C下进行细胞内染色30分钟。洗涤后，使用流式细胞仪分析细胞，每个样本至少收集10,000个淋巴细胞事件。使用FlowJo软件进行数据分析。结果表示为在相应T细胞亚群中细胞因子阳性细胞的百分比。
抗原图谱
基于中和抗体数据构建抗原图谱。采用多维标度（MDS）将高维中和数据降维到二维空间，其中抗原距离对应于免疫学距离。抗原距离定义为log2（相对中和滴度），相对中和滴度计算为测试毒株pVNT50与参考毒株pVNT50的比值。首先将pVNT50值转换为抗原距离，然后使用MDS将病毒变异株和血清样本投影到二维抗原图中，使得点之间的欧几里得距离最优地反映实际的抗原关系。使用R中的Racmacs包进行分析。图中的血清聚类代表具有相似抗体识别谱的样本，而病毒毒株的位置反映其抗原相似性。雷达图分析可视化不同血清对变异株组的整体中和模式。使用每个变异株的GMT值作为坐标轴绘制中和谱。通过面积计算量化整体中和强度，通过形状分析评估交叉反应模式。
序列比对与系统发育分析
用于系统发育和抗原分析的所有变异株序列均从NCBI Virus数据库获得。使用Clustal W算法进行多序列比对和系统发育分析。基于全长刺突蛋白氨基酸序列，使用MEGA X构建系统发育树。
量化与统计分析
所有分析均使用R软件和GraphPad Prism软件进行。中和抗体滴度以GMT及其95%置信区间（CI）表示，T细胞反应以中位数及四分位距（IQR）表示。对于多组或多变异株的横断面比较，使用Friedman检验（非参数检验，用于重复测量或匹配数据），然后使用Dunn多重比较检验进行两两比较。对于纵向配对数据（例如，BF.7/BA.5.2队列中14-28天与6个月的数据），使用Wilcoxon符号秩检验。逃逸倍数变化计算为参考毒株GMT与测试毒株GMT的比值。显著性水平表示为“ns”（不显著）；P< 0.05；P< 0.01；P< 0.001；**P< 0.0001。每次分析所使用的具体统计检验在相应的图注中说明。
结果
系统发育分析揭示新兴Omicron变异株抗原性的进化动态
为了表征新兴SARS-CoV-2 Omicron变异株之间的进化关系，我们基于全长刺突蛋白序列进行了最大似然系统发育重建，揭示了从原型株到当代Omicron变异株的复杂进化轨迹。进化轨迹图展示了Omicron变异株的逐步进化进程。BF.7/BA.5.2作为BA.4的后代，主导了2022年底中国最初的Omicron流行波。随后相继出现了重组XBB谱系和JN.1系列。在刺突蛋白突变逐渐积累的驱动下，JN.1及其后代变异株（例如NB.1.8.1、LP.8.1.1和XEC）现已达到全球优势地位，这一趋势凸显了它们在进化选择压力下的快速出现和扩张。进化图显示，BA.2.86与BA.2相比携带34个刺突蛋白突变，而BA.3.2相对于BA.3携带52个突变，凸显了这些变异株显著的遗传分化。突变分析揭示了趋同进化的显著模式，即系统发育上不同的谱系独立获得了相同的关键突变。多个变异株趋同进化出R346T突变，出现在BF.7、XBB和KP.3变异株中。类似地，L452位点（L452R或L452Q）和F486位点（F486P或F486V）的突变在后来的变异株中被重复选择，包括BF.7、BQ.1和JN.1，表明对这些氨基酸变化存在强烈的正选择。突变的系统性积累，特别是在刺突蛋白的抗原区域，为评估它们对不同康复者人群中和抗体反应和T细胞交叉反应性的影响奠定了基础。
BF.7/BA.5.2康复者表现出针对逃逸变异株的交叉中和反应减弱，但T细胞免疫持续存在
BF.7/BA.5.2康复者代表了中国早期Omicron流行阶段的主要感染人群。为了评估BF.7/BA.5.2感染后的中和广度与持久性，我们收集了康复者康复后14-28天和6个月的血清，用于针对多种SARS-CoV-2变异株的假病毒中和测试。中和抗体分析表明，康复后14-28天，血清对同源BF.7变异株表现出强劲的中和活性（GMT = 285），并对原型株（GMT = 956）有效应答。然而，血清对异源变异株表现出显著的免疫逃逸，逃逸倍数变化范围从4.57倍（LP.8.1.1）到13.36倍（KP.3）。与同源毒株相比，对所有异源变异株的中和活性均显著降低。关键的是，6个月的随访数据揭示了更明显的免疫减弱，异源变异株的免疫逃逸加剧。NB.1.8.1、LP.8.1.1和BA.3.2在6个月时表现出最强的免疫逃逸，倍数变化超过20。这表明跨变异株中和能力随时间加速下降。雷达图分析直观地展示了中和反应模式的变化。康复者血清（康复后14-28天）对异源毒株的GMT显著较低，尽管中和广度较宽。相反，6个月血清的中和谱明显变窄，强度普遍降低，表明对Omicron变异株的中和能力有限。
同时，我们使用ELISpot技术分析了康复者康复后14-28天和6个月的PBMCs。结果显示，康复后14-28天，所有康复者在用同源毒株（BF.7或BA.5.2）S1肽池刺激后均产生了强劲的抗原特异性T细胞反应（中位数 > 2,000 SFCs/106PBMCs）。重要的是，用其他Omicron变异株（包括BA.2.75、BQ.1、BQ.1.1和XBB）的S1肽池刺激也能引发高强度、强度相当的交叉反应性。与模拟对照相比，所有病毒抗原刺激的斑点形成细胞计数均显著更高，表明康复者体内建立了广泛的S蛋白特异性T细胞免疫，且变异株间无显著差异。6个月的ELISpot结果进一步证实了T细胞反应的持久性。与中和抗体的显著衰减相反，T细胞免疫反应表现出持续的趋势。ELISpot分析显示，S1肽池反应仍保持较高水平（2,500–3,500 SFCs/106PBMCs），并对不同的异源毒株（包括BA.2.75、CH.1.1、BQ.1、BQ.1.1、XBB和XBB.1.5）保持交叉反应性。此外，RBD肽池刺激引发了显著的反应（中位数 > 1,000 SFCs/106PBMCs），表明RBD区域内存在多个保守的T细胞表位，能够诱导长期免疫记忆。
XBB康复者保持短期中和反应稳定性，T细胞免疫保守
XBB康复者代表了2023年中中国Omicron感染人群的第二次高峰。我们采用相同的方法评估了XBB突破性感染诱导的适应性免疫反应。康复后7天，血清对同源毒株XBB.1.5表现出高中和活性（GMT = 479），同时对BF.7（GMT = 1,513）和原型株（GMT = 509）保持强劲反应。后来出现的变异株表现出明显的中和抗体免疫逃逸，倍数变化范围从3.82到12.56，其中NB.1.8.1变异株显示出最高的逃逸倍数变化（12.56）。14-28天的随访数据显示，尽管XBB.1.5滴度略有下降（GMT = 353），但逃逸模式与7天数据相似，血清继续表现出对JN.1谱系毒株（尤其是NB.1.8.1）的显著逃逸。雷达图分析直观地显示两个时间点几乎完全重叠。血清中和抗体滴度在短期康复期间保持相对稳定，但仍对新兴变异株提供不足的保护。
功能性T细胞反应分析揭示了与BF.7/BA.5.2康复者相似的交叉反应特征。用代表性毒株（原型株、XBB.1.5、EG.5.1和BA.2.86）的S1肽池刺激后进行ICS分析，表明在CD4+T细胞中可诱导多功能细胞因子反应（IFN-γ、TNF-α和IL-2），且异源毒株的反应强度与同源毒株XBB.1.5无显著差异。在CD8+T细胞中也观察到交叉反应性。所有测试毒株都能有效激活CD8+T细胞并实现稳定的细胞因子分泌。用四种毒株的S1肽池刺激的PBMCs均产生三种细胞因子的显著分泌，其中IFN-γ和TNF-α是主要细胞因子。这些结果再次证实了T细胞免疫的广谱性和
