《Frontiers in Immunology》：Low-dose cyclophosphamide combined with standard immunosuppressive therapy improves early response rates in severe aplastic anemia
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本研究探讨低剂量环磷酰胺（CTX）联合抗胸腺细胞球蛋白（ATG）、环孢素（CsA）及海曲泊帕（hetrombopag）作为一线方案治疗重型/极重型再生障碍性贫血（SAA/VSAA）的疗效与安全性。结果显示，3个月总缓解率（ORR）达65.1%，6个月完全缓解（CR）率提升至27.9%，且毒性可控，提示该方案可显著改善早期血液学反应，为SAA/VSAA患者提供了新的治疗选择。
背景
获得性再生障碍性贫血（AA）是一种主要由免疫失调介导的骨髓衰竭性疾病。重型再生障碍性贫血（SAA）和极重型再生障碍性贫血（VSAA）以危及血细胞减少为特征，表现为出血、感染，若未治疗一年死亡率极高。目前，抗胸腺细胞球蛋白（ATG）联合环孢素（CsA）的标准免疫抑制治疗（IST）是非移植患者的主要疗法。血小板生成素受体激动剂（TPO-RAs）的加入进一步提高了缓解率和血液学反应质量，成为当前一线治疗方案。然而，马ATG在中国不可用，而依洛塞麦（eltrombopag）全剂量在中国患者中常因肝耐受性差受限，因此海曲泊帕联合猪ATG和CsA成为中国广泛采用的IST方案。该方案的3个月缓解率约为40-50%，意味着约半数患者在关键时间点仍依赖输血。因此，提高SAA的早期疗效是未满足的临床需求。
环磷酰胺（CTX）对淋巴细胞有强效细胞毒作用，但对造血干细胞影响极小。因其能靶向B和T淋巴细胞，CTX已广泛用于多种自身免疫性疾病治疗。临床研究证实，高剂量CTX±CsA治疗SAA疗效与ATG相当，且复发风险更低，但高剂量CTX的毒性副作用限制了其在AA中的应用。基于此，研究者假设在标准IST联合海曲泊帕基础上加用低剂量CTX可能进一步提升SAA患者的早期缓解率。
方法
本研究为研究者发起的单中心、非随机、II期临床试验，采用Simon两阶段设计估算样本量，以3个月总缓解率（ORR）为主要终点。零假设（H0）为标准IST联合海曲泊帕方案的3个月ORR为45%，备择假设（H1）为ORR达65%。使用R软件（版本4.0.2）以单侧显著性水平（α）0.05和效能≥80%计算，两阶段设计总样本量为43例。若前22例患者（第一阶段）中缓解数少于9例，则停止入组。
2023年7月至2024年9月，共43例患者入组。纳入标准包括：年龄≥12岁；确诊为初治获得性SAA或VSAA；不适合或不愿接受异基因造血干细胞移植；ECOG评分≤2；能完全理解研究方案并自愿签署知情同意。排除标准包括：入组前接受TPO-RA治疗>4周；治疗开始前接受免疫抑制治疗>4周；对CTX或海曲泊帕不耐受；对猪ATG过敏；未控制的活动性感染；未控制的高血压（≥140/90 mmHg）或糖尿病（空腹血糖≥7.0 mmol/L或随机血糖≥11.1 mmol/L）；肝肾功能异常（AST或ALT>3倍正常值上限，或血肌酐≥2.5倍正常值上限）；有恶性实体瘤化疗/放疗史；有其他严重系统性疾病史；妊娠、哺乳或育龄期妇女；研究者认为可能影响研究完成的其他因素。
SAA定义为骨髓细胞度<25%且至少两项血细胞计数减低（网织红细胞计数<20×109/L，血小板计数<20×109/L，中性粒细胞计数<0.5×109/L）。VSAA为符合SAA标准且中性粒细胞计数<0.2×109/L。必须排除先天性造血衰竭。50岁以下患者需进行先天性骨髓衰竭相关突变基因筛查，50岁及以上患者需丝裂霉素C（MMC）和彗星试验阴性以排除潜在先天性遗传因素。
治疗方案为：猪ATG 25 mg/kg/天，第1-5天；CsA 3-5 mg/kg/天持续维持；海曲泊帕15 mg/天从第1天开始持续6个月；序贯低剂量CTX 20 mg/kg/天于第29-30天和第43-44天给药。支持治疗包括感染预防和输血管理按机构指南进行。感染预防和管理包括：对中性粒细胞绝对计数（ANC）<0.5×109/L患者每日给予粒细胞集落刺激因子（G-CSF）2-5 μg/kg直至ANC恢复至>5×109/L，并开始泊沙康唑抗真菌预防。治疗期间若发热，需及时进行病原学检测并根据临床表现尽早经验性抗感染治疗。
主要终点为3个月ORR，定义为治疗开始后3个月内达到完全缓解（CR）、非常好部分缓解（VGPR）、良好部分缓解（GPR）或部分缓解（PR）的患者比例。次要终点包括疗效和安全性。疗效终点包括3个月CR率和优效缓解率（CR+VGPR+GPR），以及6个月ORR、CR率、优效缓解率和达到优效缓解时间。安全性终点包括3个月内全因死亡率、≥3级治疗相关不良事件（按CTCAE v5.0）和克隆演变（通过细胞遗传学或分子谱评估）。
疗效评估标准参考《成人再生障碍性贫血诊断和治疗指南》并结合临床经验细化。CR定义为血红蛋白>10 g/dL，ANC>1.0×109/L，血小板计数>100×109/L。VGPR为血红蛋白>10 g/dL，ANC>1.0×109/L，血小板计数>80×109/L。GPR为血红蛋白>8 g/dL，ANC>1.0×109/L，血小板计数>50×109/L。PR为不再符合SAA标准且脱离输血依赖但未达上述任何缓解标准。持续输血依赖为未缓解（NR）。优效缓解包括CR、VGPR和GPR，劣效缓解为PR。
统计分析按意向性治疗（ITT）原则进行，分析人群为至少接受一剂研究药物的所有患者。分类数据以例数（n）和百分比（%）描述，连续数据根据情况报告非缺失例数、均值、标准差、中位数、最小值和最大值。率终点报告95%置信区间（CI），采用Clopper-Pearson二项分布CI计算。时间至事件数据用Kaplan-Meier分析估计并附95% CI。
结果
43例入组患者中，30.2%（13/43）诊断为VSAA。中位随访时间14.9个月（范围4.6-20.7个月）。45例患者筛查，2例治疗开始前撤回知情同意。43例入组患者中，40例（93.0%）按方案接受4次CTX输注，2例（4.7%）接受2次输注，1例（2.3%）接受1次输注。
主要终点3个月ORR为65.1%（28/43，95%CI=49.1-79.0）。3个月优效缓解率和CR率分别为25.6%（11/43，95%CI=13.5-41.2）和9.3%（4/43，95%CI=2.6-22.1）。6个月随访时，ORR较3个月无显著改善（69.8%，30/43，95%CI=53.9-82.8），但优效缓解率升至60.5%（26/43，95%CI=44.4-75.1），CR率升至27.9%（12/43，95%CI=15.3-43.7）。至首次PR的中位时间为86天（95% CI=74-109），至首次优效缓解的中位时间为131天（95% CI=100-181）。
与SAA患者相比，VSAA患者3个月ORR显著更低（30.8% vs. 80.0%；p=0.0041）。从血液学反应动力学看，3个月时15例未缓解（NR）患者中，10例（66.7%）至6个月仍未达血液学反应。相反，3个月时17例达劣效缓解患者中，13例（76.5%）进展为优效缓解（含3例CR），2例（11.8%）保持劣效缓解，1例（5.9%）复发，1例（5.9%）因无关意外死亡。
海曲泊帕、猪ATG和环孢素相关不良事件与标准IST一致，主要为血清病样反应和肝功能异常。加用CTX后，研究者评估的CTX相关不良事件包括脱发（1级，48.8%）、恶心（1-2级，100%）、中性粒细胞减少（1-4级，3级及以上62.8%）和感染（1-3级，3级25.6%）。中性粒细胞下降见于两个CTX治疗周期（周期1：第29-30天；周期2：第43-44天），周期1中性粒细胞减少中位持续时间6天（范围0-30天），周期2为4.5天（范围0-28天）。3例VSAA患者中性粒细胞计数持续低下，但这些患者CTX治疗前已处于粒细胞缺乏状态，治疗后持续中性粒细胞减少。未观察到CTX相关的血红蛋白或血小板下降。治疗3个月内总感染率60.5%，46%（20/43）患者CTX后发生新发感染，主要为发热性中性粒细胞减少（16%，7/43）、肺炎（12%，5/43）和上呼吸道感染（9%，4/43）。3个月随访期内无死亡。
基线时20.9%患者携带至少一种I型或II型基因突变。前三位突变基因为DNMT3A（25.0%）、PIGA（16.7%）和TET2（16.7%），但整个队列中这些基因的变异等位基因频率（VAF）均低于10%。至6个月时，携带I/II型体细胞突变患者比例升至51.4%（18/35），最常突变基因为PIGA（31.0%）、ASXL1（14.3%）和BCOR（14.3%）。除突变谱变化外，这些突变的VAF较基线水平上升。至末次随访日，无患者进展为骨髓增生异常综合征或急性髓系白血病。
基线时3例患者核型异常：-Y、del(13)(q12q22)和t(X;19)(p10;p10)。6个月随访时，-Y患者核型恢复正常，另两例保持原异常核型。43例患者中18例（41.9%）基线PNH克隆阳性。3个月时40例患者中16例（40.0%）仍PNH克隆阳性，6个月时阳性率为16/38（42.1%）。
讨论
本II期试验评估了低剂量CTX联合传统IST方案的改良方案，主要终点为3个月ORR。观察到3个月ORR为65.1%，高于海曲泊帕联合猪ATG和CsA的III期临床试验报告的50.6% ORR。但6个月ORR较3个月无显著改善（69.8% vs. 65.1%），而6个月CR率（27.9% vs. 9.3%）和优效缓解率（60.5% vs. 25.6%）较3个月时显著提高。值得注意的是，尽管本研究3个月ORR似乎有提高，但6个月ORR和CR率与其他标准IST方案临床研究报道相当。这表明含低剂量CTX的强化免疫抑制治疗可能使更多患者更早出现反应，但未增强缓解质量，突显了TPO-RAs在获得更高缓解质量中的关键作用。这可能与CTX作为免疫抑制剂同时靶向B和T淋巴细胞有关。更强化IST可能更早纠正免疫介导的造血衰竭，从而提升疗效。但由于CTX的细胞毒性，本研究观察到的早期反应质量并非最优，后期持续使用TPO-RA有助于改善患者缓解质量。
Brodsky等首次开创高剂量CTX用于SAA患者，10例患者中7例达CR。随后，同一团队将高剂量CTX作为初治SAA患者一线治疗，19例可评估病例2年无输血生存率73%。延长随访10年，新诊断SAA患者总生存（OS）率达88%，克隆演变率低于5%。但Scheinberg等研究显示，SAA患者中使用中剂量CTX相关毒性显著，死亡率高达14%（3/22）。与既往使用CTX和CsA的研究不同，本研究是首次将CTX与ATG和CsA联合以增强免疫抑制强度的临床尝试。为减轻毒性，将CTX剂量降至20 mg/kg/天共4剂（总累积剂量80 mg/kg），分两次周期给药（第29-30天和第43-44天）。尽管剂量优化，仍观察到短暂中性粒细胞减少（每周期中位持续时间6天）。但多数患者经G-CSF支持后中性粒细胞计数恢复，3个月随访期内无治疗相关死亡率。尽管感染发生率较标准IST方案增加，这些事件经积极抗感染治疗和标准化支持治疗仍可控制。
本研究发现6个月时体细胞突变发生率较基线增加（从20.9%至51.4%），主要涉及DNMT3A、PIGA、TET2等基因。此外，携带PNH克隆患者比例和克隆大小均呈进行性增加。这些结果与依洛塞麦联合IST的III期临床试验结果一致，该试验同样报道6个月时体细胞突变增加。研究者假设造血恢复可能涉及寡克隆扩增。换言之，造血恢复期间可能发生短暂偏移或某些祖细胞亚群选择性扩增，并不代表真正克隆演变。值得注意的是，至本队列末次随访未检测到克隆演变（如进展为MDS或AML）。但该方案是否增加克隆演变风险需延长随访确定。
本前瞻性II期试验表明，在ATG+CsA+海曲泊帕基础上加用低剂量CTX对SAA患者有益。加用低剂量CTX诱导了早期反应且毒性可耐受。本研究存在单臂设计和样本量较小的固有局限性。此外，短期随访无法就长期风险（如复发或克隆演变）得出明确结论。未来需延长长期随访，并计划开展严格设计的III期随机对照试验以明确评估CTX在新诊断SAA患者中的疗效。
