《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Optimization of mannanase expression in Aspergillus niger for enhanced production of mannan oligosaccharides
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本研究通过基因拷贝数调控（如双拷贝使转录水平提升92.00%）、分泌途径优化（Vps10缺失使酶活提高30.08%）及信号肽改造（SpepB替换使酶活增加15.41%）等多维策略，显著提升黑曲霉（Aspergillus niger）中甘露聚糖酶（mannanase）的表达水平与分泌效率，为甘露寡糖（MOS）的低成本规模化生物合成提供高效酶资源与技术支撑。
1 引言
甘露寡糖（MOS）是由2-10个甘露糖通过糖苷键连接的功能性寡糖，具有维持肠道健康、调节免疫功能等生物活性，广泛应用于饲料、食品和医药领域。β-1,4-甘露聚糖酶（β-mannanase）是MOS生物合成中的关键限速酶，其表达水平直接决定MOS的产量与成本。当前工业酶源普遍存在表达量低、分泌效率差及稳定性不足等问题，制约高性能酶制剂的可靠生产。黑曲霉（Aspergillus niger）作为安全高效的工业宿主，具备蛋白质高产能力（达40 g·L?1）和复杂的翻译后修饰系统，但其异源蛋白表达受限于细胞内严格的分泌质量控制。本研究以工业糖化酶生产菌株黑曲霉TH-2为底盘，通过多维度策略系统提升甘露聚糖酶的表达与分泌效率。
2 材料与方法
2.1 菌株与培养条件
实验所用黑曲霉TH-2及其衍生菌株（如ΔasAA::pyrG、Vps::pyrG）通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化构建。发酵培养基为葡萄糖（100 g·L?1）、玉米浆（20 mL·L?1）和豆粉（20 g·L?1），pH 5.5–6.0，30°C振荡培养。
2.2 甘露聚糖酶基因克隆与表达载体构建
从黑曲霉TH-2基因组中扩增出1,200 bp的甘露聚糖酶基因（man），并构建含不同拷贝数（1-3拷贝）及信号肽（SglaA或SpepB）的表达载体，如pSZHG6R-man1R（单拷贝）、pSZHG6R-man2R（双拷贝）和pSZHG6R-man3R（三拷贝）。载体通过酶切连接验证正确性（Supplementary Figure S1）。
2.3 重组黑曲霉菌株的生成
通过农杆菌介导的转化将表达载体整合至黑曲霉基因组中的glaA高表达位点，获得重组菌株M1R（单拷贝）、M2R（双拷贝）、M3R（三拷贝）、ΔAM3R（三拷贝且缺失AsAA）、ΔVM2R（双拷贝且缺失Vps10）和PM2R（双拷贝且使用SpepB信号肽）。
2.4 蛋白表达与酶活性分析
发酵12天后收集上清液，通过SDS-PAGE和ImageJ灰度分析量化甘露聚糖酶表达水平。酶活性测定采用DNS法，以70°C、pH 3.5条件下水解魔芋粉生成还原糖的量计算酶活（单位：U·L?1）。
2.5 转录水平分析
通过RT-qPCR检测man基因及内质网应激（UPR）相关基因（hacA、bipA、pdiA）的转录水平，以actA为内参基因，采用2?ΔΔCt法计算相对表达量。
2.6 菌株生长特性评估
测定固体培养基上菌落直径及液体发酵后菌丝湿重，评估遗传改造对菌株生长的影响。
2.7 底物特异性与MOS制备工艺优化
以魔芋粉、瓜尔胶等为底物，通过单因素实验优化水解条件（温度、pH、酶剂量、时间、底物浓度），并通过薄层色谱（TLC）和质谱（MS）分析产物组成。
3 结果
3.1 高效甘露聚糖酶生产菌株的构建
成功构建含不同拷贝数及信号肽的重组菌株（表2）。双酶切验证载体正确性（图1），基因组PCR确认靶基因整合。
3.2 重组菌株中甘露聚糖酶的分泌表达
SDS-PAGE显示所有重组菌株均在37 kDa处出现特异性条带（图2A）。双拷贝菌株M2R的蛋白表达量显著高于单拷贝M1R和三拷贝M3R。ΔVM2R（Vps10缺失）和PM2R（SpepB信号肽）的条带灰度值分别为M2R的1.18倍和1.14倍（图2B）。酶活测定表明，M2R酶活最高（21,289.84 U·L?1），而ΔVM2R进一步提升至27,692.80 U·L?1（较M2R提高30.08%），PM2R为24,571.36 U·L?1（提高15.41%）。三拷贝菌株M3R酶活仅为6,242.89 U·L?1，但缺失AsAA的ΔAM3R酶活恢复至17,207.96 U·L?1（提高175.64%）（图3）。
3.3 优化策略对转录活性的影响
RT-qPCR显示，双拷贝菌株M2R的man基因转录水平为单拷贝M1R的192%，三拷贝M3R达267%。ΔAM3R较M3R转录水平提升10.11%，ΔVM2R和PM2R较M2R分别提升24.48%和7.29%（图4a）。UPR相关基因（hacA、bipA、pdiA）在三拷贝菌株中显著上调，表明内质网应激加剧（图4c-e）。
3.4 菌株生长状态分析
三拷贝菌株M3R菌落直径和菌丝湿重均显著低于其他菌株，而ΔAM3R、ΔVM2R和PM2R生长状态与M1R无显著差异（图5），说明过量表达引发生长抑制，但通过背景蛋白缺失或分泌途径优化可缓解此效应。
3.5 甘露聚糖酶催化合成MOS的工艺分析
酶解魔芋粉主要生成二糖至七糖，MOS总含量达94.47%（图6，表3）。单因素实验确定最优水解条件为pH 4.5、70°C、底物浓度10 g·L?1、酶剂量0.5 mg·mL?1（图7）。
4 讨论
本研究通过多维策略显著提升黑曲霉中甘露聚糖酶的产量。双拷贝为最优基因剂量，三拷贝因触发UPR而抑制表达。缺失背景蛋白AsAA可缓解内质网负荷，使三拷贝菌株酶活提升175.64%；Vps10缺失通过阻断液泡降解途径使酶活提高30.08%；SpepB信号肽因疏水核心结构更优，较SglaA提升酶活15.41%。与酵母表达系统相比，黑曲霉平台具备更高效的分泌能力和工业适配性。酶解工艺优化后MOS产率高达94.47%，凸显其工业化潜力。未来需通过响应面法（RSM）进一步优化工艺，并探索酶固定化技术以提升稳定性。
5 结论
本研究成功建立黑曲霉中甘露聚糖酶的高效表达体系，证实基因拷贝数调控、分泌途径优化及信号肽工程协同提升酶产量。重组酶对魔芋粉水解效率高，为MOS规模化生产提供关键技术支撑。所构建的多维工程框架为工业酶的高效生物制造奠定理论基础。
