《Journal of the Science of Food and Agriculture》：Bioaccessibility of anthocyanins and bioactive compounds from Brazilian berries and their food matrix interaction: an in vitro gastrointestinal digestion study coupled to UHPLC-ESI-TQD-MS/MS analysis
引言
浆果类水果因富含花青素等生物活性化合物而被认为对健康有益，尤其是对慢性非传染性疾病（如代谢综合征和神经退行性疾病）的预防具有潜在作用。花青素作为类黄酮的一种，赋予浆果蓝色、紫色、红色或黑色，并具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗突变特性。然而，花青素要发挥其健康益处，必须通过胃肠道消化后成为生物可及的形式，即从食物基质中释放出来并溶于水相，以便被肠道吸收。生物可及性受多种因素影响，包括食物基质、化合物的化学性质、在食物中的定位、结构特性、溶解度和在胃肠道消化过程中的稳定性。其中，食物基质可能是最关键的因素之一。植物细胞壁在消化过程中被破坏后，可能与多酚发生相互作用，影响其生物可及性，这种影响取决于多酚的分子结构。食物基质中的蛋白质也可能增强或降低多酚的生物可及性。然而，关于不同食物基质如何影响花青素生物可及性的理解仍存在空白。因此，理解消化过程中发生的变化对于评估各种浆果中花青素的生物可及性和生物活性至关重要。
体外模拟消化是一种模拟人体消化过程的方法，可在肠道水平获得相关的生物可及性组分。这些方法快速、安全、可靠且可重复，没有体内模型的伦理限制。先前的研究已使用体外消化来评估纯化花青素提取物的生物可及性，评估其稳定性、生物可及性和代谢。类似地，也有研究通过体外消化评估了胃肠道消化对越橘酱中花青素和抗坏血酸抗氧化活性的影响。结果表明，食物基质在消化过程中显著影响生物活性化合物的稳定性。
商业浆果通常生长在温带气候，难以适应巴西和热带气候，导致全球供应有限和商业化成本高。巴西拥有巨大的生物多样性，特别是在大西洋森林和塞拉多生物群落中，蕴藏着许多未知的水果物种。此外，大规模的森林砍伐和对自然保护的忽视使许多巴西本土水果物种濒临灭绝。然而，研究这些本土水果符合联合国可持续发展目标，涉及社会、经济和环境方面，以保护资源、保护生态系统并促进人类和地球的长期福祉。
在巴西本土浆果中，包括南布里（Rubus urticaefolius）、黑皮坦加（Eugenia uniflora var. rubra Mattos）、格鲁米沙马（Eugenia brasiliensis）和巴拉皮罗卡（Eugenia involucrata）——也称为里奥格兰德樱桃。我们决定保留这些水果的土著名称，因为这对于保护巴西原住民的种族特性和传统知识至关重要。这些浆果由于其紫黑色，预计含有相当浓度的花青素，并且是昂贵的进口浆果的良好替代品。
先前的研究已部分分析了这些浆果的治疗潜力和化学组成，显示出有希望的结果。格鲁米沙马的花青素主要包括飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷以及苷元飞燕草素和矢车菊素。皮坦加的乙醇提取物对高适口性饮食喂养的大鼠代谢参数显示出预防效果，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷被确定为主要花青素。巴拉皮罗卡的乙醇提取物显示出有希望的酚类组成，以及体外抗氧化和抗肿瘤潜力，其中矢车菊素、飞燕草素和天竺葵素衍生物是主要花青素。尽管关于巴西浆果组成的全面研究有限，但皮坦加、格鲁米沙马、南布里和巴拉皮罗卡还提供其他营养素和抗氧化剂，如维生素C、单宁、生育酚、类胡萝卜素和矿物质。皮坦加含有丰富的类胡萝卜素，尤其是番茄红素、可水解单宁和维生素C。格鲁米沙马的果皮分析发现富含缩合单宁和生育酚。巴拉皮罗卡提供B族维生素——主要是核黄素——单宁、维生素A原类胡萝卜素和生育酚。据我们所知，这是首次分析南布里（Rubus urticaefolius）的近似组成、花青素谱和抗氧化效果。
除了关于黑皮坦加、格鲁米沙马、南布里和巴拉皮罗卡浆果的生物活性和生物活性化合物的有希望的结果外，它们的花青素在胃肠道消化中的行为仍需研究。因此，分析花青素生物可及性和生物活性的体外消化研究是阐明其主要作用机制并突出这些浆果作为健康促进剂的初始途径，同时理解和保护巴西的生物多样性。本工作的目的是评估黑皮坦加、格鲁米沙马、南布里和巴拉皮罗卡的体外胃肠道消化对花青素生物可及性和生物活性的影响，并将结果与食物基质组成相关联；其原创性基于科学探索这些巴西本土浆果的创新和可持续性特征。
材料与方法
样品处理与实验设计
黑皮坦加（Eugenia uniflora var. rubra Mattos）、格鲁米沙马（Eugenia brasiliensis）、南布里（Rubus urticifolius）和巴拉皮罗卡（Eugenia involucrata）在达到最大紫黑色时从巴西圣保罗州Ribeir?o Preto和Campinas市的果园采收，并新鲜运至实验室。首先，水果在饮用水中清洗，然后去除种子和叶子，只保留可食用部分（果肉和果皮），但南布里除外，其种子小而可食用，因此被保留。样品在Ultra-Turrax（14,000 rpm, IKA, Staufen, Germany）中均质化1分钟，并储存在-18°C的聚丙烯管中直至分析。
水果最初提取如下：将2克均质样品与15毫升含有1%甲酸的80%甲醇通过连续浸渍（三次）在玻璃瓶中进行提取，并在超声波浴中放置10分钟。提取物在15毫升聚丙烯管中以5000 rpm离心5分钟，仅收集上清液。完全提取后的最终体积为50毫升，这与体外消化中的样品质量与体积比例相同。这些初始水果提取物经过过滤（0.22 μm），并通过分光光度分析和超高效液相色谱-电喷雾电离-三重四极杆-串联质谱（UHPLC-ESI-TQD-MS/MS）进行分析。
进行体外消化的水果分析如下：（i）生物可及部分——即超速离心后消化样品的上清液——经过过滤（0.22 μm）用于分光光度分析；（ii）该生物可及部分的等分试样也使用SPE柱进行纯化，用于UHPLC-ESI-TQD-MS/MS分析；以及（iii）超速离心后的沉淀（即未消化残留物）用上述溶剂进行提取。详细的体外消化方案如下所述，以及超速离心和纯化步骤的细节。
体外胃肠道消化
本研究中使用的模拟体外消化程序严格遵循INFOGEST协议中提出的参数。该协议中唯一做的调整是在模拟唾液流体（SSF）中添加了尿酸（0.3 mg mL?1）、尿素（4 mg mL?1）和黏蛋白（1 mg mL?1）。选择此调整是因为当人类摄入富含花青素的水果时，花青素明显粘附在唾液和口腔黏膜上。
每个样品有四个重复，第一个重复仅用于测量pH调整。样品（2克）从口腔消化过程开始消化，包括含有尿酸、尿素、黏蛋白和α-淀粉酶的SSF。在消化的每个阶段，将试管在带有轨道振荡的水浴（Dubnoff）中孵育，确保在整个消化阶段控制温度和混合。之后，装有样品的试管通入氮气覆盖并用水封膜密封后再孵育。对于体外消化，使用α-淀粉酶（75 U mL?1）、胃蛋白酶（2000 U mL?1）、胰酶（100 U mL?1）、胆汁（10 mmol L?1）、脂肪酶（60 U mL?1）和电解质溶液，遵循协议以及pH值和孵育参数——即口腔阶段pH 7，37°C下2分钟；胃阶段pH 3，37°C下2小时；肠道阶段pH 7，37°C下2小时。
体外消化后，将试管从水浴中取出并置于冰上，然后立即用0.5毫升甲酸酸化以维持花青素稳定性。随后将试管进行超速离心步骤（24,000 × g，4°C，45分钟）以分离生物可及部分，即含有释放出的可溶性化合物的上清液。尽可能使用注射器和针头收集生物可及部分。然后使用0.22 μm纤维素过滤器过滤该部分，通入氮气，用水封膜密封并在-80°C冷冻。保留的沉淀按上述方法进行提取，代表未消化残留物，并用于计算花青素的稳定性。
获得的生物可及部分使用SPE柱（Bond Elut C18, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）清除极性化合物，如糖、盐、酸和其他干扰物质，以便注入UHPLC-ESI-TQD-MS/MS系统。我们进行了初步测试，注射经过和未经过SPE清洁的样品生物可及部分，发现经过SPE清洁的分析产生的噪音更低，色谱峰形更好，相对回收率高于85%。SPE柱用1毫升含有1%甲酸的甲醇活化。接着，使600 μL的生物可及部分通过SPE柱。然后，使2毫升酸化水（1%甲酸）通过SPE，保留花青素并丢弃废液。随后，加入300 μL酸化甲醇，过滤内容物并直接收集到小瓶中，用于注入UHPLC-ESI-TQD-MS/MS系统。生物可及性和稳定性按照先前报道的公式计算。
UHPLC-ESI-TQD-MS/MS
花青素谱的鉴定和定量使用配备电喷雾电离源（Xevo TQS Zspray, Waters）的三重四极杆质量检测器的UHPLC-ESI-TQD-MS/MS系统（Waters Corp., Milford, MA, USA）进行分析。选择了一种经过验证的快速方法用于主要花青素的分离和定量。将样品注入UHPLC-ESI-TQD-MS/MS系统，条件如下：流速0.35 mL min?1，使用含有1%甲酸的水（A）和含有1%甲酸的乙腈（B）作为流动相，梯度洗脱从1分钟时的90:10（A:B）到4分钟时的50:50（A:B）；总运行时间为9分钟；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm（Waters）。进行标准品的直接灌注以使用软件的Intellistart功能确定质谱模块的最佳鉴定参数。电离源和去溶剂化的温度分别为150°C和300°C。锥孔和毛细管电压分别为3.1 kV和49 V。质谱仪在正离子模式下运行。使用纯标准品矢车菊素-3-葡萄糖苷氯化物、飞燕草素-3-葡萄糖苷氯化物、天竺葵素-3-葡萄糖苷氯化子和锦葵素-3,5-二葡萄糖苷氯化物（Phytolab GmbH & Co., Vestenbergsgreuth, DE）构建四条不同浓度范围的校准曲线。校准曲线信息见支持信息。
每个标准品及其相应碎片确定的精确质量为：矢车菊素-3-葡萄糖苷，449.107；287.055/162.052；飞燕草素-3-葡萄糖苷，465.380；303.048/162.052；天竺葵素-3-葡萄糖苷，433.114；271.060；锦葵素-3,5-二葡萄糖苷，655.481；493.43/162.052。由于这些参数与文献一致，此外，还使用来自分析Eugenia uniflora、Eugenia brasiliensis和Eugenia involucrata的作者的质量数据搜索了其他预期的花青素。应用MRM（多反应监测）模式同时搜索15种不同的化合物。因此，我们还能够在样品中鉴定出锦葵素-3-阿拉伯糖苷/木糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、锦葵素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-木糖苷、飞燕草素-3-阿拉伯糖苷、飞燕草素-3-木糖苷和矮牵牛素-3-葡萄糖苷/半乳糖苷。
近似组成
近似组成按照Adolfo Lutz研究所和AOAC国际认可的程序标准测定，详情如下。
水分含量通过在105°C的烘箱中干燥至恒重测定，使用强制通风干燥箱，根据AOAC方法。灰分含量通过在550°C的马弗炉中煅烧直至完全矿化测定，根据AOAC方法。
蛋白质含量通过凯氏定氮法测定，该方法涉及在催化剂存在下用浓H2SO4消解，在凯氏蒸馏装置中蒸馏释放的氨，并用标准HCl溶液滴定。总氮值使用因子6.25转换为粗蛋白，按照FAO/WHO和Southgate的建议。
脂质含量根据Bligh和Dyer方法测定，该方法涉及使用高速匀浆器将样品与氯仿和甲醇（2:1, v/v）匀浆，用水进行相分离，并在减压下溶剂蒸发后定量脂质部分。
膳食纤维（总纤维、可溶性和不溶性）使用MES-Tris缓冲液通过酶-重量法测定，根据Lee等人的方法。总碳水化合物含量通过差减法计算，从100中减去水分、蛋白质、脂质、灰分和膳食纤维的总和。能量值（kcal）使用Atwater转换因子（蛋白质和碳水化合物为4 kcal g?1，脂质为9 kcal g?1）估算。所有测定均进行三次平行，结果以鲜重为基础表示。
分光光度分析
总多酚化合物使用Folin–Ciocalteu试剂测定，结果表示为没食子酸当量（μg GAE）。总黄酮根据Zhisen等人的方法测定；结果表示为儿茶素当量（μg CE）。单体花青素根据Giusti和Wrolstad的pH差分法定量。最终吸光度使用公式计算，花青素含量计算为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）。其中A是吸光度，C是浓度，MW是分子量（449.2），DF是稀释因子，ξ是摩尔吸光系数（26,900 mol L?1），L是光路长度（cm）。
氧自由基吸收能力（ORAC）测定基于Ou等人先前描述的方法。使用荧光衰减曲线下的面积计算结果，结果表示为Trolox当量（μmol TE）。铁离子还原抗氧化能力（FRAP）根据Benzie和Strain的方法进行。结果表示为Trolox当量（μmol TE）。使用阳离子自由基ABTS•+根据Rufino等人描述的方法测定抗氧化能力。Trolox用作校准曲线的标准品，结果表示为Trolox当量（μmol TE）。吸光度/荧光在Synergy HT酶标仪（BioTek, Winooski, VT, USA）上读取，该仪器与Gen5 2.0数据软件程序相连。
统计学分析
统计学分析包括Student's t检验和方差分析（ANOVA；单因素和双因素），随后进行Tukey检验以比较两个或多个均值。P ≤ 0.05的值被认为具有显著性。使用MiniTab 17（Minitab LLC, State College, PA, USA）和GraphPad Prism 8.4.3（GraphPad LLC, Boston, MA, USA）软件进行分析。数据表示为平均值±标准差。在Metaboanalyst 5.0中进行进一步的统计分析，用于关联体外胃肠道消化后特征之间以及特征与样品之间的相关性。经过总和归一化、平方根变换和自动缩放后，将近似组成、化合物生物可及性和稳定性、总化合物含量和抗氧化能力特征提交进行主成分分析（PCA）和Pearson's R相关性分析，截止值为P > 0.7。
结果
通过UHPLC-ESI-TQD-MS/MS鉴定和定量花青素
使用UHPLC-TQD-MS/MS获得了水果中主要花青素的鉴定和相对丰度，数据如表1所示。通过注射这些标准品，确认了矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷和锦葵素-3,5-二葡萄糖苷的准确鉴定，证实这些化合物存在于所有四种分析的浆果中。该鉴定表明，化合物的质量、碎片和鉴定参数与文献中发现的一致。然后，除了使用的四种标准品外，还能够鉴定出这些化合物的七种其他衍生物：锦葵素-3-阿拉伯糖苷/木糖苷；锦葵素-3-葡萄糖苷；矢车菊素-3-阿拉伯糖苷；矢车菊素-3-木糖苷；飞燕草素-3-阿拉伯糖苷；飞燕草素-3-木糖苷；和矮牵牛素-3-葡萄糖苷/半乳糖苷。除了质量和碎片外，洗脱顺序也用于化合物鉴定。
所有浆果中存在的主要花青素是矢车菊素-3-葡萄糖苷，在南布里中含量最高（99.3%），其次是黑皮坦加（98.5%）、格鲁米沙马（97.3%）和巴拉皮罗卡（90%）。尽管含量低于矢车菊素-3-葡萄糖苷，但在所有水果中都发现了少量矢车菊素-3-木糖苷：格鲁米沙马（1.09%）；巴拉皮罗卡（0.88%）；黑皮坦加（0.30%）；和南布里（0.06%）。天竺葵素-3-葡萄糖苷也少量存在于所有水果中，相对丰度为巴拉皮罗卡1.63%，黑皮坦加0.82%，南布里0.50%，格鲁米沙马0.21%。在巴拉皮罗卡中发现了飞燕草素-3-葡萄糖苷和飞燕草素-3-木糖苷的亮点，相对丰度分别为5.2%和1.5%。
表2展示了初始新鲜浆果中四种花青素的定量及其在体外消化后生物可及部分中的含量。如所示，矢车菊素-3-葡萄糖苷在所有浆果中浓度最高，顺序如下：黑皮坦加（1156 μg g?1）> 巴拉皮罗卡（1002 μg g?1）> 南布里（954 μg g?1）> 格鲁米沙马（251 μg g?1）。黑皮坦加和格鲁米沙马在飞燕草素-3-葡萄糖苷和锦葵素-3,5-二葡萄糖苷的含量上没有显著差异。飞燕草素-3-葡萄糖苷在巴拉皮罗卡 > 南布里 > 格鲁米沙马中呈现第二高浓度；然而，对于黑皮坦加，第二高浓度是天竺葵素-3-葡萄糖苷。所有浆果中测定含量最低的花青素是锦葵素-3,5-二葡萄糖苷。
体外消化后生物可及部分中测定的花青素含量也呈现在表2中。尽管“生物可及性”一词更常见，但释放出来并可生物利用的生物活性物质的量在生物学上更具相关性。在此基础上，矢车菊素-3-葡萄糖苷在测量的花青素中在生物可及部分中显示出最高含量，而其生物可及浓度在南布里（642 μg g?1）中最高，其次是黑皮坦加（435 μg g?1）、巴拉皮罗卡（246 μg g?1）和格鲁米沙马（120 μg g?1）。体外消化后未再检测到锦葵素-3,5-二葡萄糖苷；然而，该化合物在初始浆果中含量较低，因此可能低于检测限。飞燕草素-3-葡萄糖苷在南布里 > 巴拉皮罗卡 > 格鲁米沙马的生物可及形式中仍然是第二多的化合物，而对于黑皮坦加，天竺葵素-3-葡萄糖苷是生物可及部分中第二定量多的化合物。根据结果，南布里是含有较高量生物可及飞燕草素-3-葡萄糖苷、锦葵素-3,5-二葡萄糖苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷的浆果。
通过UHPLC-ESI-TQD-MS/MS分析的花青素稳定性和生物可及性
稳定性数据（图2）代表体外消化后回收的花青素总量，包括生物可及部分和未消化部分，相对于初始量，从而反映了化合物在整个消化过程中的化学稳定性。它代表了花青素的保留——即在体外消化步骤中对降解的抵抗力。此外，稳定性有助于推断在消化过程中发生化学转化但可能具有生物学相关性的花青素——即被代谢的花青素。所有定量花青素和样品的体外消化稳定性均高于40%。飞燕草素-3-葡萄糖苷是黑皮坦加最稳定的化合物（120.8%），其次是天竺葵素-3-葡萄糖苷（99%）。锦葵素-3,5-二葡萄糖苷是格鲁米沙马稳定性最高的化合物（107.3%），而飞燕草素-3-葡萄糖苷表现出相似的稳定性（97.7%）。巴拉皮罗卡和南布里最稳定的化合物是天竺葵素-3-葡萄糖苷（分别为84.1%和94.6%）。对于巴拉皮罗卡浆果，锦葵素-3,5-二葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷表现出相似的稳定性（约50%）。飞燕草素-3-葡萄糖苷是巴拉皮罗卡和南布里稳定性最低的化合物（分别为50.20%和41.59%）。尽管生物可及量很小，但化合物锦葵素-3,5-二葡萄糖苷在所有分析的浆果中显示出高于50%的稳定性。发现稳定性超过100%（图2）并不令人惊讶，因为稳定性结果的可变性包括独立分析的生物过程三个不同步骤（初始、生物可及和残留）的误差，并且花青素的最终量——即体外消化后——在统计上并不高于初始样品。
生物可及性数据（图3）代表每种测量的花青素在消化过程中从食物基质中释放、保持化学稳定并溶于水相的部分，从而可用于胃肠道吸收。这些数据以百分比表示，使我们能够比较不同样品在生物活性化合物变得可生物利用的效率方面的差异。它还使我们能够开始解释作用机制和生物可及性调节，如食物基质干扰。南布里显示出最高的矢车菊素-3-葡萄糖苷生物可及性（67.4%），其次是格鲁米沙马（47.9%）、黑皮坦加（37.6%）和巴拉皮罗卡（24.5%）。黑皮坦加在花青素生物可及性方面没有显示出显著差异，保持在35%左右。锦葵素-3,5-二葡萄糖苷是格鲁米沙马中生物可及性最高的化合物；然而，该化合物在浆果中的含量并不高。巴拉皮罗卡是所有花青素生物可及性最低的浆果，除了天竺葵素-3-葡萄糖苷为20%，仅高于格鲁米沙马（14%）。这些实验的一个局限性是所选择的提取和分析方法不侧重于花青素的结合或聚合形式，这可能低估了其在稳定性和生物可及性结果中的作用。
总酚类化合物、总黄酮和总单体花青素
巴西浆果模拟消化前后生物活性化合物的分光光度分析结果——即初始值和生物可及值，显示在表3中。根据Folin–Ciocalteu测试，估计的初始总酚含量顺序为：格鲁米沙马 > 巴拉皮罗卡 > 南布里 > 黑皮坦加。关于黄酮——酚类化合物中最大的一类，包括花青素——巴拉皮罗卡超过格鲁米沙马，领先于南布里和皮坦加。然而，皮坦加的黄酮占总酚含量的比例最高（53.2%）。花青素是所有水果中主要的黄酮亚类，至少占总黄酮的51.4%（巴拉皮罗卡），范围从黑皮坦加的351 μg C3G g?1到南布里的555 μg C3G g?1。
体外胃肠道消化改变了生物活性化合物的含量，不同水果之间的变化程度不同（表1）。体外消化后，格鲁米沙马仍然是酚类含量最高的，尽管仅呈现初始值的52.5%，而其他三种水果之间的初始差异在体外消化后不再存在。体外消化后，所有水果的总黄酮（17.7–69.4%）和花青素（37.5–70.3%）含量也观察到显著降低。有趣的是，尽管南布里和巴拉皮罗卡的初始花青素值相似，但这些化合物的生物可及部分值在消化结束时不同，表明食物基质组成对生物可及性的影响。
生物可及性数据有助于预测将在肠道水平可用于抗氧化作用的生物活性化合物的量。皮坦加和南布里表现出较高的酚类生物可及性——超过100%——这伴随着消化后的抗氧化活性结果（图4和图5）。相应地，观察到格鲁米沙马消化后抗氧化活性受到负面影响，这与总酚类物质的低生物可及性有关。
消化后，格鲁米沙马（82.3%）和南布里（67.5%）的黄酮生物可及性高于皮坦加（30.6%）和巴拉皮罗卡（41.0%）（图4）。关于花青素，南布里（62.5%）和皮坦加（57.3%）的生物可及性高于格鲁米沙马（35.2%）和巴拉皮罗卡（29.7%）（图4）。因此，黄酮现在在皮坦加和南布里的生物可及部分中完全由花青素代表，而它们在格鲁米沙马和巴拉皮罗卡中的代表性分别减少
