《Advanced Science》：Palmitoylation-Mediated Ubiquitination of SRPK1 Regulates Ferroptosis in High-Fat-Induced Erectile Dysfunction
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本研究揭示了棕榈酸（PA）通过ZDHHC24/APT1调控的SRPK1动态S-棕榈酰化，促进E3泛素连接酶MIB1介导的K494位点泛素化降解，进而影响p53 Ser15磷酸化及核转位，最终通过GPX4通路抑制内皮细胞铁死亡，为血脂异常相关ED提供了新的治疗靶点（如化合物4'-O-Methylochnaflavone）。
1 引言
勃起功能障碍（ED）是一种持续无法达到或维持足以满足性活动的勃起，严重影响生活质量和心理健康。尽管口服磷酸二酯酶抑制剂仍是主要治疗手段，但基础与转化研究不断揭示新的病理生理机制和治疗靶点。值得注意的是，ED也是主要心血管疾病的早期临床标志，为识别心血管风险升高的男性提供了宝贵工具。常见合并症包括高血压、肥胖、血脂异常和糖尿病，凸显了ED发展的代谢和血管基础。特别是，高达42.4%的ED男性存在高脂血症，胆固醇水平异常与中重度疾病显著相关。然而，与糖尿病诱导或神经源性相关的ED相比，高脂血症相关ED在机制层面的探索相对不足。因此，深入了解高脂饮食（HFD）引起ED的细胞和分子机制，特别是在血管健康背景下，对于识别新的治疗靶点和开发有效干预措施至关重要。
功能性血管网络的形成对全身细胞健康至关重要，尤其是在心血管系统内。内皮细胞构成血管和淋巴管的内表面，在营养和氧气输送、免疫细胞运输、血流调节和组织稳态维持中发挥关键作用。这些细胞的功能障碍和死亡与糖尿病、高血压、血脂异常和肥胖等慢性疾病密切相关。在各种代谢改变中，棕榈酸（PA）对血管功能、免疫和炎症具有深远影响。作为一种在棕榈油和动物脂肪中普遍存在的饱和脂肪酸，PA已被广泛记录为促进蛋白质S-棕榈酰化的主要脂肪酸底物。蛋白质棕榈酰化，也称为S-酰化或S-棕榈酰化，是一种基于PA和半胱氨酸残基之间硫酯键的可逆脂质修饰，可以影响与膜结构域相关的亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质稳定性。先前的研究表明，PA暴露与内皮细胞功能障碍和铁死亡的进展有关，暗示其在心血管疾病和具有共同危险因素的ED发病机制中的作用。了解调节性内皮细胞死亡的机制可能会拓宽肥胖和血管并发症患者的治疗策略。
丝氨酸-精氨酸蛋白激酶（SRPKs）代表一个独特的蛋白激酶亚家族，选择性磷酸化富含丝氨酸/精氨酸（SR）结构域的剪接因子，在mRNA剪接、肿瘤发生和内皮功能中发挥关键作用。特别是，SRPK1通过调节血管内皮生长因子A（VEGF-A）的可变剪接来调节血管生成，促进促血管生成亚型的表达，从而影响新血管形成。此外，SRPK1可以通过其与Akt磷酸酶PHLPP1的相互作用调节Akt激活，从而既作为癌基因又作为肿瘤抑制因子发挥作用。先前的研究强调了SRPK1/Akt轴在PA诱导的内皮细胞功能障碍和细胞活力受损中的关键作用。SRPK1的酶活性通过多种机制进行微调，包括自身磷酸化。另一层调控由TIP60依赖性乙酰化提供，调节其自身磷酸化、稳定性和细胞分布。有研究提出，细胞周期蛋白D1上调触发神经系统中的细胞周期进程，其中SRPK2磷酸化并激活剪接因子SC35，然后损害p53蛋白丝氨酸（Ser, S）15的磷酸化。然而，SRPK1在p53信号通路中的作用及其其他翻译后修饰（PTMs）仍然不清楚。
在本研究中，我们揭示了ZDHHC24介导的SRPK1 S-棕榈酰化（被APT1拮抗的过程）与增强的泛素化和蛋白酶体降解相关。这种调节机制将SRPK1与p53激活和内皮细胞铁死亡联系起来，以响应PA和HFD，突出了SRPK1作为血脂异常相关ED和血管功能障碍的潜在治疗靶点。
2 结果
2.1 PA促进SRPK1的泛素化依赖性降解
为了研究SRPK1在HFD诱导的内皮功能障碍和细胞死亡中的参与，我们首先使用免疫荧光（IF）测量了喂食正常饲料或HFD的大鼠海绵体中SRPK1的表达。结果显示，与对照组相比，HFD喂养大鼠内皮细胞中的SRPK1蛋白水平显著降低，这与我们之前的观察一致，即PA暴露以浓度依赖性方式降低内皮SRPK1表达。
为了阐明蛋白质水平降低背后的机制，我们在转录和翻译后水平检查了SRPK1。值得注意的是，在PA处理的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和大鼠海绵体内皮细胞（RCCEC）中，SRPK1的mRNA水平升高，表明在这些情况下其转录并未受损。放线菌酮（CHX）追踪实验显示，在PA处理的RCCEC中，内源性SRPK1的半衰期缩短，表明PA显著损害了SRPK1蛋白的稳定性。进一步研究表明，蛋白酶体抑制剂MG-132有效阻断了PA诱导的SRPK1降解，而自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）没有显著影响。一致地，使用抗泛素抗体的免疫印迹显示，在PA处理的RCCEC中，SRPK1存在明显的多聚泛素化。这些发现暗示泛素-蛋白酶体系统（UPS）在SRPK1的降解过程中发挥作用。
为了探索可能参与SRPK1多聚泛素化的赖氨酸残基，我们在用BSA或PA处理的内皮细胞中进行了泛素化蛋白质组质谱分析。值得注意的是，一个包含人SRPK1赖氨酸494（K494）的泛素化肽段（该残基从鱼类到哺乳动物进化上保守）在PA处理的细胞中与对照组相比显著富集。因此，我们在激酶结构域中生成了赖氨酸到精氨酸（K494R）突变体。外源表达的SRPK1-K494R-Myc显示出与野生型（SRPK1-WT-Myc）相比显著降低的多聚泛素化。有趣的是，尽管含赖氨酸的肽段VKIADLGNACWVHK也存在于SRPK2中，但PA处理以剂量和时间依赖性方式增加了SRPK2蛋白水平，而没有相应的多聚泛素化水平增加。
2.2 E3泛素连接酶MIB1调节SRPK1的泛素化降解
为了识别负责SRPK1多聚泛素化的E3泛素连接酶，我们使用抗SRPK1抗体或IgG对照与来自用PA和MG-132处理的RCCEC裂解物进行免疫沉淀（IP），然后进行质谱分析。值得注意的是，E3泛素连接酶MIB1被鉴定为排名最高的蛋白质。MIB1介导Delta受体的泛素化，该受体作为Notch蛋白的配体并诱导Notch信号反应。先前的研究使用串联泛素结合实体分析将SRPK1鉴定为MIB1介导的直接泛素化的强潜在候选者。它们在HEK293T细胞中共转染SRPK1-Myc和MIB1-Flag，通过共免疫沉淀（Co-IP）实验证实了它们的相互作用，并在RCCEC中针对内源性SRPK1和MIB1进一步验证。
MIB1的结构域结构包括MZM、REP、ANK和RING结构域。N端的MZM和REP结构域促进底物识别，而RING结构域通过E2结合介导泛素转移。另一方面，SRPK1包含一个N端结构域、一个间隔插入结构域和两个激酶结构域。我们发现，与MIB1-WT相比，MZM缺失和REP缺失的MIB1突变体消除了与SRPK1-Myc的结合，表明MZM-REP结构域是与SRPK1结合所必需的。同时，删除SRPK1-Myc中的N端结构域显著削弱了其与MIB1-Flag的相互作用，这意味着该区域介导了其与MIB1的相互作用。
在过表达MIB1-WT的细胞中，SRPK1的蛋白水平降低，而催化失活突变体MIB1-C985S没有显著影响。进一步的泛素化实验证明，MIB1-WT增强了SRPK1的多聚泛素化，而MIB1-C985S则没有。相反，通过小发夹RNA（shRNA; shMIB1）敲低MIB1显著恢复了PA处理的RCCEC中SRPK1蛋白的稳定性并降低了其多聚泛素化。类似地，我们也在HEK293T细胞中观察到敲低MIB1影响了SRPK1的多聚泛素化水平。总之，这些发现确立了MIB1作为SRPK1多聚泛素化和蛋白酶体降解的关键调节因子。
2.3 SRPK1在Cys188/502/647的S-棕榈酰化对其降解至关重要
PTMs对于蛋白质功能、定位和稳定性具有重要意义，尤其是不同PTM之间复杂的相互作用。除了泛素化，我们假设S-棕榈酰化可能有助于SRPK1的降解，因为PA暴露可以影响蛋白质S-棕榈酰化动力学。为了实验验证SRPK1的S-棕榈酰化，我们用2-溴棕榈酸酯（2-BP）（一种ZDHHC蛋白酰基转移酶的广谱抑制剂）处理RCCEC，这有效挽救了PA诱导的SRPK1降解。在HEK293T细胞中，用2-BP处理降低了外源表达的SRPK1-Myc的多聚泛素化水平，而不干扰MIB1表达。此外，我们在过表达SRPK1的HEK293T细胞中进行了酰基-生物素交换（ABE）实验，以选择性检测棕榈酰化蛋白质。首先用N-乙基马来酰亚胺（NEM）封闭游离巯基，接着用羟胺（HAM）介导的棕榈酰修饰切割和随后的生物素化。然后使用链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白质，并通过免疫印迹进行分析。我们的结果表明，在用2-BP处理的RCCEC中，SRPK1 S-棕榈酰化水平降低，而在PA暴露下增强。这些发现表明SRPK1经历了S-棕榈酰化，可能影响其稳定性。
为了识别SRPK1中的关键棕榈酰化位点，我们使用S-棕榈酰化位点预测工具（GPS-Palm软件）过滤SRPK1可能的棕榈酰化位点。我们发现人SRPK1的半胱氨酸（Cys, C）188、502和647在物种间保守且得分相对较高。为了验证这些位点，生成了棕榈酰化缺陷突变体（半胱氨酸变为丝氨酸），并使用ABE实验进行测试，结果显示突变C188/C502/C647中的任何一个或两个部分影响SRPK1 S-棕榈酰化，而同时突变三个残基（3CS）则消除了SRPK1 S-棕榈酰化。此外，SRPK1的多聚泛素化水平在3CS突变体中显著降低，表明这些位点的S-棕榈酰化对于SRPK1多聚泛素化至关重要。
为了深入了解S-棕榈酰化对SRPK1降解的结构影响，我们使用AlphaFold进行了计算机结构建模。预测的在C188/C502/C647处棕榈酰化的SRPK1的全局结构与未修饰的蛋白质非常相似，表明S-棕榈酰化不会引起大规模构象变化。由于三个棕榈酰化残基在空间上靠近泛素化位点K494，并且S-棕榈酰化可以调节蛋白质-蛋白质相互作用，我们假设S-棕榈酰化可能影响MIB1和SRPK1之间的相互作用，从而影响SRPK1降解。Co-IP实验证实，与SRPK1-3CS突变体相比，MIB1和SRPK1-WT之间的结合增强，表明SRPK1 S-棕榈酰化促进了SRPK1-MIB1相互作用。随后的CHX追踪实验表明，与SRPK1-WT相比，SRPK1-3CS的半衰期延长，揭示了SRPK1在C188/C502/C647处的S-棕榈酰化促进了蛋白质降解。总之，这些数据支持SRPK1在Cys188/502/647处的S-棕榈酰化对于MIB1介导的泛素化和蛋白酶体降解至关重要。
2.4 APT1和ZDHHC24介导SRPK1的S-棕榈酰化
蛋白质S-棕榈酰化是由锌指DHHC结构域包含的棕榈酰转移酶（ZDHHCs）家族催化的，在哺乳动物中已鉴定出23个成员，并被去棕榈酰酶如酰基蛋白硫酯酶（APTs）、溶酶体水解酶PPT1和ABHD蛋白家族成员所拮抗。我们观察到，用ML348药理学抑制由基因LYPLA1编码的APT1，而不是用ML349抑制APT2，导致SRPK1蛋白水平显著降低。Co-IP分析证实了这一点，它证明了SRPK1和APT1之间存在相互作用。此外，APT1的基因敲低和药理学抑制都导致SRPK1 S-棕榈酰化增加和蛋白水平降低，而APT1过表达则引起相反的效果。与这些发现一致，SRPK1多聚泛素化在APT1敲低或抑制后显著增强，并在APT1过表达后降低。
为了确定负责SRPK1 S-棕榈酰化的棕榈酰酰基转移酶，我们在HEK293T细胞中使用经过验证的siRNAs沉默了各种ZDHHC酶。ABE实验显示，与其它ZDHHCs相比，敲低ZDHHC24显著减少了SRPK1 S-棕榈酰化，并降低了其多聚泛素化。然后我们证实ZDHHC24与SRPK1相互作用，导致SRPK1蛋白丰度降低。所有这些发现表明APT1和ZDHHC24可能是介导SRPK1动态和可逆S-棕榈酰化的主要酶。
2.5 SRPK1介导p53在Ser15的磷酸化
我们之前的RNA测序（RNA-seq）数据集（GEO: GSE205913）显示，在用PA处理的内皮细胞中，p53信号通路和铁死亡显著富集，这种情况同时降低了SRPK1蛋白水平。为了进一步描述SRPK1在这些通路中的作用，我们对SRPK1敲低后从HEK293T细胞提取的总RNA进行了RNA-seq（GEO: GSE283448）。基因集富集分析显示，与p53活性相关的基因在多个通路中发生显著变化，包括p53信号通路、铁死亡、细胞周期调控和细胞衰老。此外，VEGF信号通路成为排名最高的通路之一，这与VEGF可变剪接和SRPK1之间已确立的联系一致。进一步的分析，包括GSEA和可变剪接事件检查，证实了SRPK1功能丧失。我们观察到SRPK1敲低降低了内皮细胞中的p53蛋白水平，而在PA处理的RCCEC中，SRPK1的过表达消除了这种效应。我们的质谱分析最初提示SRPK1和p53之间存在潜在的相互作用，随后通过Co-IP分析得到证实。重要的是，在两个RNA-seq数据集（GEO: GSE205913, GSE283448）中，TP53的mRNA水平基本保持不变，表明SRPK1可能通过PTMs而非转录调控来调节p53活性。
尽管SRPK1传统上被认为是用于富含SR结构域底物（参与剪接）的蛋白激酶，但其在调节p53磷酸化中的潜在作用仍不清楚。我们发现SRPK1促进了p53在Ser15的磷酸化，这削弱了其与MDM2的相互作用，减少了其多聚泛素化，并增强了p53的核积累。一致地，CHX追踪实验显示，在过表达SRPK1的HEK293T细胞中，p53的半衰期延长，表明SRPK1有助于p53蛋白的稳定。此外，通过APT1破坏SRPK1 S-棕榈酰化可能会影响p53在Ser15的磷酸化。除了SRPK1，泛素化蛋白质组质谱还鉴定出一个包含人p53赖氨酸139（K139）的泛素化肽段，该肽段在PA处理的细胞中显著增加。Co-IP和免疫印迹实验进一步证明，与p53-WT-HA相比，p53-K139R-HA突变体表现出显著降低的多聚泛素化，可能影响p53蛋白的稳定性。p53的结构域组成包括N端结构域（N）、DNA结合结构域（DBD）、四聚化结构域（TD）和C端结构域（C）。我们发现，删除p53中的N端结构域消除了与SRPK1-Myc的结合，而野生型则没有，表明N端结构域与SRPK1结合。总之，这些发现表明SRPK1介导p53在Ser15的磷酸化。
2.6 SRPK1减轻PA相关的内皮细胞铁死亡
作为抑制肿瘤生长的独立通路，p53在调节铁死亡（与代谢和氧化应激反应紧密相关）中扮演着关键而复杂的作用。先前的研究表明，p21（一种常见的p53下游分子）通过调节GPX4发挥抗铁死亡作用。值得注意的是，SRPK1过表达特异性抑制了由RSL3（一种GPX4的直接抑制剂）诱导的铁死亡，而不是Erastin（胱氨酸/谷氨酸逆向转运体系统Xc?的抑制剂）诱导的铁死亡，突出了SRPK1与GPX4的相互作用，而不是对胱氨酸代谢的上游调控。有趣的是，来自用SPHINX31（一种SRPK1酶活性的选择性抑制剂）处理的RCCEC的RNA-seq数据集（GEO: GSE211557）显示出与铁死亡和亚铁（Fe2+）稳态相关的基因特征显著富集，暗示SRPK1在内皮细胞铁死亡中发挥调节作用。同时，PA处理对其他已知的铁死亡调节因子（包括FSP1和ACSL4）的蛋白水平影响很小。PA诱导的内皮细胞死亡被铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）挽救，而不是针对其他形式细胞死亡的抑制剂，从而证实了其对铁死亡的特异性。相比之下，另一种常见的饱和脂肪酸油酸对SRPK1和GPX4表达没有显著影响。此外，铁稳态的关键调节因子FTH1和FTL1在SRPK1敲低组中显著降低，并在SRPK1过表达组中上调，进一步巩固了铁死亡与SRPK1之间的联系。与对照组相比，PA诱导的铁死亡在SRPK1过表达组中得到改善，表现为GSH水平增加、ROS积累减轻和Fe2+水平降低。我们还发现，SRPK1的过表达和p53的激活改善了PA处理的RCCEC中GPX4的表达。
为了进一步验证内皮SRPK1表达与血脂异常相关ED之间的体内相关性，我们使用腺相关病毒（AAV）9型（AAV-SRPK1）生成了SRPK1表达载体，并将其局部注射到海绵体中。免疫荧光分析证实了AAV注射后内皮特异性的SRPK1表达。与AAV-Vector对照组相比，内皮SRPK1过表达的大鼠表现出勃起功能的部分恢复，尽管在HFD喂养后体重或血清脂质谱没有观察到显著变化。一致地，内皮SRPK1表达显著降低了铁死亡标志物，表现为4-HNE（4-羟基壬烯醛，一种脂质过氧化产物）水平降低以及p53和GPX4表达增加。另一方面，抑制或敲低SRPK1促进了ROS积累，升高了细胞内Fe2+水平，并降低了GSH水平，表明SRPK1可能在内皮细胞铁死亡中起决定性调节作用。
接下来，我们通过将Rosa26LSL-Srpk1小鼠与VE-钙粘蛋白-Cre（Cdh5-Cre+）转基因小鼠杂交，生成了内皮特异性Srpk1敲入（Srpk1-EKI）小鼠，并用16周HFD喂养小鼠以诱导ED。与内皮特异性AAV干预一致，我们观察到在HFD喂养的Srpk1-EKI小鼠中，与对照组相比，勃起功能改善，4-HNE水平降低。在HFD喂养的Srpk1-EKI组中，p53和GPX4的内皮表达也增加了。这些发现突出了SRPK1在减轻内皮细胞铁死亡和恢复血管功能中的作用。
2.7 4'-O-Methylochnaflavone与SRPK1相互作用并维持其稳定性
类黄酮是一类广泛已知具有强效抗氧化和抗炎特性的多酚化合物，通过抑制氧化应激和炎症在维持血管内皮功能中发挥关键作用。我们之前的研究已经证明，依卡里苷II可能通过与SRPK1潜在结合来减轻PA诱导的内皮功能障碍，以及扁柏黄酮通过EGFR信号通路减轻HFD诱导的ED。基于此前提，通过计算机分析从类黄酮库中筛选与SRPK1潜在相互作用的小分子化合物。亲和力分析显示，4'-O-Methylochnaflavone（MF）表现出相对较高的结合能力。作为阳性对照，占据SRPK1结合口袋的SPHINX31显示出可比的结合亲和力。此外，我们通过生物素-MF下拉进一步证实了SRPK1和MF之间的相互作用。鉴于MF与SRPK1复合物中的潜在结合位点位于多聚泛素化位点K494附近，我们提出MF可能影响SRPK1的多聚泛素化过程。确实，在用MF处理的RCCEC中，SRPK1的多聚泛素化受到损害，而SPHINX31没有表现出这种效果。此外，在用MF或SPHINX31处理的RCCEC中，Srpk1的mRNA水平没有显示出显著差异。这些结果表明，MF与SRPK1相互作用并与减少的多聚泛素化相关，从而稳定了蛋白质。
我们进一步评估了MF在PA诱导的SRPK1蛋白降解和HFD诱导的ED中的作用。在PA处理的RCCEC中，免疫印迹显示MF以剂量依赖性方式恢复了SRPK1蛋白水平，同时伴随着p53和GPX4表达的增加。此外，MF处理还降低了细胞内Fe2+水平并挽救了GSH耗竭，表明其在抑制脂质积累诱导的铁死亡方面有效。我们探索了MF在HFD喂养的啮齿动物模型中内皮细胞铁死亡发展过程中的治疗潜力。HFD喂养、MF处理（HFD-MF）组的勃起功能与HFD喂养、载体处理（HFD-vehicle）组相比显著改善。此外，与HFD-vehicle组相比，HFD-MF组的血清脂质水平和脂肪组成略有改善。与这些观察一致，MF的给药有效增强了啮齿动物模型中内皮p53和GPX4的表达，并减少了脂质过氧化。我们的数据还显示，注射铁死亡抑制剂Liproxstatin-1（Lip-1）显著减轻了HFD诱导的ED，并降低了阴茎组织中的4-HNE水平。总之，这些发现表明，MF通过维持SRPK1稳定性和调节GPX4表达来减轻内皮细胞铁死亡。
3 讨论
多种代谢综合征，包括肥胖、高血压和糖尿病，破坏内皮稳态并引发一系列病理事件，最终导致内皮功能障碍、细胞死亡以及心血管疾病和ED风险增加。在代谢紊乱患者中高度流行的血脂异常加剧了内皮损伤、氧化应激和血管重塑，从而损害勃起功能。ED被认为是一种多因素疾病
