移植成熟肝细胞通过转化为AFP阳性重编程细胞促进损伤后肝脏再生

《Advanced Science》：Conversion of Transplanted Mature Hepatocytes into Afp+ Reprogrammed Cells for Liver Regeneration After Injury

本研究揭示了移植成熟肝细胞在肝脏损伤后通过重编程为甲胎蛋白（AFP）阳性重编程肝细胞（Afp+rHep）实现高效再生的新机制。文章综合运用谱系追踪、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）技术，发现Afp+rHep通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）通路依赖的代谢重编程，协调增殖与功能成熟。中性粒细胞来源的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）/激活蛋白-1（AP-1）信号驱动其增殖，而转化生长因子-β（TGF-β）介导的迁移先于代谢分区化。该研究阐明了终末分化肝细胞介导肝脏再生的分子基础，为优化基于肝细胞的再生疗法提供了新靶点。

　　

移植成熟肝细胞通过转化为AFP阳性重编程细胞促进肝脏再生

摘要

肝脏损伤后，移植的成熟肝细胞展现出显著的再生能力。本研究旨在解析其背后的细胞状态转变和分子调控机制。通过整合连续移植、谱系追踪、单细胞多组学分析，发现供体肝细胞在宿主损伤微环境中转化为一种过渡性的甲胎蛋白（AFP）阳性重编程肝细胞（Afp⁺rHep）。这些细胞在维持单向肝向分化潜能的同时，表现出可控的增殖能力，使其在快速扩增后能实现完全的功能性成熟。

引言

肝细胞移植是治疗肝功能衰竭的有效方法，但移植的成熟肝细胞驱动的再生机制尚不完全清楚。成熟肝细胞保留着肝祖细胞基因的可及染色质区域，赋予其响应损伤的重编程潜能。在诸如3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可力丁（DDC）诱导的损伤中，白细胞介素-6（IL-6）/信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号驱动肝细胞转化为肝脏祖细胞样细胞（LPLC）。在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的损伤中，界面区的肝细胞会上调胎儿特异性基因。部分肝切除（PHx）研究也证实肝细胞经历“出生后样重编程”。本研究在此基础之上，深入探讨了移植肝细胞在宿主损伤微环境中的重编程和增殖过程。

结果

移植成熟肝细胞通过重编程获得增殖能力

为了研究移植的成熟肝细胞如何再生受损肝脏，研究人员通过AAV8-TBG-Cre病毒特异性标记Rosa26-LSL-tdTomato小鼠的成熟肝细胞，并将其移植到延胡索酰乙酰乙酸水解酶缺陷（Fah^-/-）小鼠体内。停止给予保护性药物2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮（NTBC）后，移植的肝细胞迅速定植、增殖并有效重建肝脏结构和功能。通过两轮连续移植策略和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，发现移植后的肝细胞在早期（1-3周）经历广泛的转录组重塑，形成一个独特的过渡细胞群体（Group1），该群体高表达甲胎蛋白（Afp）等肝祖细胞标志物，并表现出细胞周期活性。免疫荧光染色证实，移植后1周，大部分tdTomato⁺供体细胞共表达AFP，且其比例随时间推移而下降；增殖标志物Ki67的阳性率在3周达到峰值。这表明细胞先经历命运决定（1周），再进行增殖扩张（3周）。这些过渡细胞，即Afp⁺重编程肝细胞（Afp⁺rHep），在损伤微环境中还表现出显著的应激适应能力，特别是激活了氧化应激反应（OSR）通路。

过渡性Afp⁺重编程肝细胞（Afp⁺rHep）部分转录相似于未成熟肝细胞且功能上不同于损伤诱导的LPLC

为了表征过渡细胞，研究人员将移植肝细胞数据与小鼠肝脏发育图谱数据整合分析。主成分分析（PCA）显示，过渡细胞（移植后1-3周）形成了一个独立于从E10.5到成年正常发育连续体的独特集群。它们选择性模仿出生后肝细胞（P3-P12）的转录谱，在保留代谢相关基因表达的同时，重新激活生物合成基因。基因集富集分析（GSEA）表明，移植重编程细胞（Tr）在转录上更接近未成熟肝细胞（IH），最显著的是细胞周期通路的激活。而DDC重编程细胞（DDC）则保留核心肝细胞成熟标志物并获得胆管细胞特征基因。重要的是，基因表达谱和免疫荧光染色证实，tdTomato⁺AFP⁺移植细胞持续表达肝细胞身份标志（FAH⁺HNF4α⁺），且不表达胆管细胞标志物（Sox9^-CK19^-）。因此，尽管过渡细胞与LPLC共享部分重编程特征，但它们在分化轨迹和命运定向上存在根本差异。研究人员将这群细胞正式定义为Afp⁺重编程肝细胞（Afp⁺rHep）。

Afp⁺rHep通过协调激活完整的能量生产轴而呈现代谢优化状态

基因集变异分析（GSVA）显示，Afp⁺rHep特异性激活了糖酵解、三羧酸循环（TCA循环）、氧化磷酸化（OXPHOS）和氨基酸代谢通路。单细胞代谢通量估计证实了这些细胞中丙酮酸、草酰乙酸和乙酰辅酶A等关键节点的通量增加，表明建立了一个活跃的、为能量生产和生物质合成做准备代谢网络。跨急性损伤模型（PHx、CCl₄、APAP）和LPLC的代谢通路富集评分PCA分析显示，移植的Afp⁺rHep（Tr_1W, Tr_3W）占据了一个空间上独特的集群。深入分析发现，Afp⁺rHep、LPLC和APAP再生肝细胞都进行了广泛的代谢重编程。其中，Afp⁺rHep在OXPHOS和TCA循环方面表现出比其他状态更显著的富集。更重要的是，高Afp表达与PPAR信号（α/γ）、脂肪酸氧化（FAO）、TCA循环和OXPHOS的协调上调同时发生，代表了完整的线粒体能量生产轴的高保真执行。因此，Afp⁺rHep是功能优化的代谢状态的典型，其特征是协调的PPAR-FAO-TCA-OXPHOS能量生产轴，并与持续高Afp表达共同定义。

代谢-增殖耦合是Afp⁺rHep异质性的基础

伪时间分析揭示了Afp⁺rHep中存在分支轨迹，表明其存在固有的细胞异质性。根据Afp表达水平，可进一步分为Afp^low和Afp^high两个亚群。共识轨迹分析确定了两条独立路径：Path1捕获Afp^low细胞内部的分化，Path2代表从Afp^low到Afp^high细胞的命运转变。基因本体（GO）和趋势分析表明，Afp^low细胞主要参与物质代谢和细胞周期相关过程，表现出增殖细胞特征；而Afp^high细胞特异性激活外源性刺激反应信号，并同时表达细胞周期抑制标志物Cdkn1a/p21。细胞周期分析显示，Path1末端的c2细胞（Afp^low-cycling）表现出增殖特征，G2/M期比例增加；而Path2末端的c3细胞（Afp^high）尽管处于伪时间末端，但其细胞周期分布与早期c1细胞（Afp^low）相似。在蛋白水平上，增殖区室（FAH⁺Ki67⁺）内的AFP平均荧光强度显著较低。这些数据表明Afp^high细胞通过“代谢适应-增殖停滞”的表型在损伤微环境中维持存活和功能。

中性粒细胞来源的TNF-α通过激活AP-1促进移植肝细胞的增殖

调控网络分析提名了一个包含6个AP-1转录因子（JUN, JUNB, JUND, FOS, FOSB, ATF3；称为“6A”）的模块作为Afp⁺rHep中的核心调控子。染色质可及性分析证实了AP-1结合基序在Afp⁺rHep，尤其是Afp^low亚群中的显著富集。这反映在增强的AP-1转录因子活性和整合的调控子活性上。6A调控子的预测靶点包含了大多数ARS基因，并富集在细胞周期和E2F靶标通路中，直接将6A与增殖联系起来。为了直接验证AP-1活性的功能必要性，研究人员在移植模型中用AP-1抑制剂T-5224处理受体小鼠。药理抑制AP-1严重损害了供体肝细胞的再殖能力并显著降低了宿主存活率，证实AP-1活性对于成功的肝脏再殖是必需的。

研究人员进一步寻找激活AP-1的上游信号。6A调控子靶向由TNF-α和IL-6介导的炎症通路。通路活性分析显示，Afp⁺rHep对TNF-α信号而非IL-6信号产生了选择性反应。这得到了这些细胞中TNF-α受体基因Tnfrsf1a（TNFR1）特异性上调的支持。PROGENy分析进一步证实了在增殖性Afp^low亚群中包括TNF信号在内的促有丝分裂通路活性增强。

为了确定TNF-α的来源，研究人员分析了再殖期间的肝脏微环境。中性粒细胞是Tnf的主要表达者，而库普弗细胞（KC）是Il6的主要来源。细胞间通讯分析将TNF信号列为供体肝细胞的顶级传入通路之一，主要来源于中性粒细胞。最稳健的相互作用是中性粒细胞来源的TNF与供体肝细胞表达的TNFR1之间的相互作用。中性粒细胞也是制瘤素M（OSM）的关键来源。这些结果共同定义了一个中性粒细胞-肝细胞轴，其中中性粒细胞来源的TNF-α，通过TNFR1信号传导，激活AP-1转录模块以许可移植肝细胞的增殖性进入，而共同传递的OSM可能保护其上皮身份。

移植肝细胞表现出分子分区化延迟但通过EMP增强的迁移增强肝脏再殖

为了定义再殖供体肝细胞的分区化动力学，研究人员使用已发表的方法计算了分区化评分。这些评分在R0_0W时间点表现出最大的异质性，移植后急剧下降，随后在再生过程中稳步增加。为了解析这些演变的分子特征，研究人员开发了一个高性能的肝细胞分区化计算分类器。将该分类器应用于宿主肝细胞揭示了分区化比例的改变。关键的是，对供体Afp⁺亚群的分析揭示了其门静脉周围位置与获得的分子身份之间的分歧。Afp^high细胞尽管位于门静脉附近，却获得了Zone 3样（中央静脉）的转录状态，这一特征与其特化的脂质分解代谢和解毒功能一致，并指示了代谢驱动的身份适应。

跨移植时间点的分子分区化重建揭示了宿主肝脏环境中供体肝细胞空间身份的显著动态变化。特别是，Zone2比例在第一轮移植时间线中持续扩张。这一趋势在第二轮模式中被逆转，Zone2代表性逐渐收缩。

研究人员接下来检查了移植肝细胞在四个再殖阶段的空间位置。移植后1周，宿主肝脏结构保持完整，供体细胞仅定植于Zone1。到第3周，结构破坏变得明显，供体肝细胞开始增殖并初步侵入相邻区域。到第6周，观察到几乎完全的宿主肝细胞耗竭，使得供体细胞能够迁移到Zone3区域。到第12周，供体肝细胞实现了完全的肝脏再殖，占据了肝小叶的所有空间域。这些发现表明，解剖学定位在分子分区化成熟之前稳定下来，在再生肝脏中建立了一个空间占据先于功能特化的顺序模式。

为了描绘控制分子分区化的信号通路，研究人员首先使用基因签名评分量化了单个肝细胞中的KEGG通路活性。然后采用动态时间规整分析来测量通路激活动力学与Zone1-3比例波动之间的时间耦合。该分析提名炎症和代谢信号通路为前五个候选通路。对分区和时间点上JAK-STAT和PPAR信号动力学的重点研究揭示了PPAR激活模式在所有三个区域始终区分肝细胞身份，这表明PPAR在建立和维持分区边界中起基本作用。

肝脏的再殖可能不仅需要局部扩张，还需要优先招募到严重损伤部位。这一模型得到了三个证据线的证实：首先，早期再殖期间的Afp⁺rHep表现出显著的促迁移通路（TGFβ, MAPK, PI3K）激活；其次，移植后1-6周的肝细胞持续富集Anxa2⁺迁移肝细胞基因签名，且未损害上皮完整性或极性；第三，到移植后6周，移植肝细胞的广泛小叶分布与细胞极性的维持和重建空间相关，为成功的迁移和整合提供了直接证据。

进一步分析表明，Afp⁺rHep表现出独特的分子谱，同时上调上皮和间质标志物并激活关键的上皮-间质转化（EMT）调节因子。免疫组化染色证实了这些细胞中上皮标志物CK18和间质标志物FN1的共表达，展示了经典的上皮-间质可塑性特征。在转录组水平上，基因集富集分析表明这些细胞显著富集于一个已建立的上皮-间质可塑性基因签名。值得注意的是，上皮-间质可塑性通路活性在Afp^low细胞中最高，并在Afp^high、宿主和成年肝细胞中逐渐降低，确立了Afp^low亚群为主要迁移动力。

讨论

终末分化细胞的重编程为克服基于细胞的肝功能衰竭及其他终末期疾病疗法的局限性提供了新的再生范式。本研究建立了一个机制框架，阐释移植的成熟肝细胞如何通过重编程为过渡性的Afp⁺rHep状态来再生肝脏。研究证明AFP作为核心调节因子，通过PPARγ信号通路驱动代谢适应，使移植细胞能够在损伤微环境中存活和增殖，这一机制通过激动剂/拮抗剂研究及其在多种损伤模型中的广泛肝保护作用得到验证。此外，研究描绘了一个协调的促再生微环境：中性粒细胞来源的TNF-α激活AP-1调控子，特异性促进受体高表达Afp^lowrHep的增殖，而OSM信号有助于维持肝细胞身份。PPARγ/AFP轴和TNF-α/AP-1通路的功能必要性通过体内直接扰动实验得到确认。

研究的局限性

先前一项关于门静脉周围损伤诱导的肝脏再生模型的研究证实，肝细胞在肝损伤后一周内可发生重编程。本研究结果显示，几乎所有的tdTomato⁺供体肝细胞在移植后1周内转化为Afp⁺rHep，突出了早期调控事件在驱动供体细胞表型转变中的关键作用。然而，有几个技术和方法学的限制需要承认。首先，在此早期阶段，宿主肝脏中移植的肝细胞数量极其有限，这给基于tdTomato的单细胞分析带来了挑战。其次，尽管在移植后3周收集了样本，但scATAC-seq未能稳健地检测到Afp^high供体来源的细胞，限制了我们对其调控机制的理解。第三，一个关键限制是将Afp⁺rHep与再殖肝细胞联系起来的证据是相关性的。本研究缺乏来自AFP-Cre模型的明确谱系追踪数据，而这是正式确立直接前体-产物关系所必需的。

结论

本研究阐明了移植成熟肝细胞在肝脏再生过程中经历重编程转化为Afp⁺rHep状态的分子和细胞基础。这一过程受到PPARγ/AFP代谢轴和TNF-α/AP-1有丝分裂信号的关键调控，并涉及代谢重编程、空间分区化以及与其他肝脏细胞的复杂相互作用。该研究为开发基于肝细胞的肝脏疾病新疗法提供了重要的理论依据和潜在靶点。